N4 亚型流感病毒检测试剂盒 新品

该类试剂盒通常采用实时荧光定量 RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）技术。

核心原理：TaqMan 荧光探针法。

靶基因：针对 N4 亚型流感病毒基因组中神经氨酸酶（NA）的保守区域设计特异性引物和探针。

检测过程：

逆转录（RT）：将样本中的病毒 RNA 反转录成 cDNA。

PCR 扩增：利用特异性引物对 cDNA 进行扩增。

荧光检测：探针结合到扩增产物上，随着扩增进行，探针被切断释放荧光信号。仪器实时监测荧光强度，从而判断样本中是否含有 N4 亚型病毒核酸。

 2. 试剂盒组成 (典型配置)

一个标准的 48 人份/盒（或 48 次反应/盒）的试剂盒通常包含以下组分：

组分名称 规格 (示例) 作用 保存条件

PCR 反应液 500 μL (2×) 含 dNTPs、Mg2、缓冲液 -20℃

酶混合液 50 μL 含逆转录酶、Taq DNA 聚合酶 -20℃

N4 特异性引物/探针混合液 50 μL 识别 N4 亚型特异序列 -20℃

阳性对照 50 μL 含 N4 靶基因片段的质粒 (高浓度) -20℃

阴性对照 100 μL 无菌水或缓冲液 2-8℃或-20℃

内标 (Internal Control, IS) 50 μL 用于监控提取和扩增过程是否正常 -20℃

 3. 适用样本与操作流程

适用样本类型：

禽类样本：鸭、鹅、鸡等禽类的咽喉拭子、泄殖腔拭子。

组织样本：病死禽的肺脏、脾脏、脑组织等。

环境样本：活禽交易市场的污水、笼具涂抹液。

操作流程详解：

第一步：样本采集与处理

使用无菌棉拭子采集禽类咽喉或泄殖腔分泌物，放入含病毒保存液（VTM）的采样管中。

第二步：病毒 RNA 提取

使用病毒 RNA 提取试剂盒（如磁珠法或柱提法）从样本液中提取总 RNA。

注意：此步骤至关重要，需防止 RNA 酶降解。

第三步：PCR 反应体系配置 (20 μL 体系示例)

在冰上配制反应混合液：

2× qPCR Mix: 10 μL

引物/探针混合液: 1 μL

酶混合液: 0.4 - 1 μL

模板 RNA: 5 - 10 μL

无核酸酶水: 补足至 20 μL

第四步：上机扩增

仪器设置：荧光通道通常选择 FAM（用于检测病毒）和 VIC/HEX（用于检测内标）。

反应程序：

逆转录：42℃ - 50℃ (30-60 分钟)

预变性：95℃ (2-5 分钟)

循环扩增：95℃ 15秒 → 60℃ 30-60秒 (采集荧光)，进行 40-45 个循环。

第五步：结果判读

阳性 (+)：FAM 通道出现典型的“S”型扩增曲线，且 Ct 值 < 35（或根据说明书设定阈值）。

阴性 (-)：FAM 通道无扩增曲线，或 Ct 值 > 40。

内标 (IS)：VIC 通道必须有正常扩增曲线（Ct 值 < 35），表明样本提取和扩增过程无抑制物干扰，结果才有效。

 4. 关键注意事项

防污染 (重中之重)：

PCR 实验室必须严格分区（试剂准备区、样本制备区、PCR 扩增区）。

阳性对照含有高浓度的病毒核酸片段，极易造成气溶胶污染，导致假阳性。操作时必须小心，加完样后立即密封离心。

试剂保存：

试剂盒通常需要 -20℃ 避光保存。

严禁反复冻融。反复冻融会降低酶的活性，导致灵敏度下降。