PAT基因检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

产品名称： PAT基因核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

检测目标： 转基因作物中的 PAT 基因序列。

主要应用：

转基因筛查： 由于PAT基因常作为标记基因插入多种转基因作物（如玉米、大豆、水稻等），该试剂盒可用于初步筛查样本是否含有转基因成分。

食品/饲料检测： 用于定性或定量检测加工食品、饲料原料中的转基因污染。

科研验证： 验证转基因植株是否成功转化了目的基因。

 2. 检测原理

该试剂盒采用TaqMan荧光探针法实时荧光定量PCR（qPCR）技术：

特异性扩增： 针对PAT基因序列设计特异性的引物和探针。

荧光标记： 探针的5'端标记荧光报告基团（通常为FAM），3'端标记荧光淬灭基团（如TAMRA或MGB）。

信号释放： 在PCR扩增过程中，Taq酶会切断与模板结合的探针，使报告基团与淬灭基团分离，释放出荧光信号。

实时监测： 荧光信号的强度与PCR产物的量成正比，通过仪器实时监测荧光变化，实现对PAT基因的精准检测。

3. 试剂盒组成

以常见的48测试/盒规格为例，试剂盒通常包含以下组分：

组分名称 规格/体积 保存条件 功能说明

PCR反应液 约800 μL/管 -20℃避光 含dNTPs、Mg2、缓冲液、特异性引物

酶混合液 适量 (如50 μL) -20℃ 含Hot Start Taq酶、UNG酶（防污染）

阳性对照 (PC) 1管 -20℃ 含PAT基因片段的质粒DNA或阳性样本

阴性对照 (NC) 1管 4℃或-20℃ 无菌双蒸水或缓冲液，用于监控污染

说明书 1份 常温 详细操作步骤及判读标准

 4. 操作流程详解

第一步：样本DNA提取 (样本制备区)

样本类型： 植物叶片、种子、加工食品（如面粉、油粕）、饲料等。

提取方法： 使用CTAB法或商业化植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。

要求： 提取的DNA应溶解在无菌水或TE缓冲液中，避免含有PCR抑制剂（如多糖、酚类物质）。

第二步：反应体系配制 (试剂准备区)

解冻： 将反应液和酶混合液从-20℃取出，在冰上解冻，涡旋混匀并瞬时离心。

配制： 按说明书比例混合反应液与酶液（例如：19 μL反应液 + 1 μL酶液 = 20 μL总体系）。

分装： 将配好的混合液分装至PCR八联管或反应管中。

第三步：加样

向上述反应管中分别加入 5 μL 模板DNA。

空白对照/阴性对照： 加入5 μL阴性对照品（无菌水）。

阳性对照： 加入5 μL阳性对照品。

待测样本： 加入5 μL提取好的样本DNA。

注意： 加样过程需在冰上操作，加完后盖紧管盖，防止挥发和交叉污染。

第四步：PCR扩增 (扩增区)

仪器设置： ABI 7500、CFX96、LightCycler等实时荧光定量PCR仪。

荧光通道： 选择 FAM 通道（检测报告基团）。

反应程序（参考）：

预变性： 95℃ 5-10 min (1 cycle)

PCR扩增： 95℃ 15 sec → 60℃ 30-60 sec (40-45 cycles，于退火延伸步骤采集荧光)

第五步：结果分析

基线设定： 根据仪器噪声情况设定，通常取3-15个循环。

阈值设定： 阈值线应刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。

 5. 结果判定标准

有效实验判定：

阴性对照 (NC)： 无Ct值（或Ct值 ≥ 40），扩增曲线为直线或轻微斜线。

阳性对照 (PC)： Ct值 ≤ 36，且扩增曲线呈典型的“S”型。

若对照不符合上述标准，实验无效，需重做。

样本结果判定：

阳性 (+)： Ct值 ≤ 36，且扩增曲线呈明显的“S”型。表明样本中含有PAT基因，即检测到转基因成分。

阴性 (-)： Ct值 ≥ 40，或无Ct值，曲线为直线。表明样本中未检测到PAT基因。

可疑 (灰区)： Ct值在 36-40之间。

建议：重新提取DNA或调整模板浓度复测。若复测结果Ct值仍小于40且呈S型曲线，则判为阳性；否则判为阴性。