PAT基因检测试剂盒（恒温荧光法） 新品

PAT基因检测试剂盒（恒温荧光法）

检测原理（恒温荧光法）：

该技术利用具有链置换活性的DNA聚合酶（如Bst酶），在单一恒定温度（通常为60-65℃）下，对靶序列进行指数级扩增。

核心机制：

恒温扩增：反应体系在60-65℃下保持恒温，无需热循环仪。

自循环扩增：利用4-6条特异性引物识别靶基因的6-8个不同区域，形成茎环结构，实现自动循环扩增。

荧光检测：反应体系中加入了荧光染料（如SYTO-9、Calcein等）或特异性探针。随着DNA扩增产物的增加，荧光染料嵌入双链DNA中发出荧光，或探针被切割释放荧光信号。

结果判读：仪器实时监测荧光强度。如果样本中含有PAT基因，荧光信号会随时间呈指数上升，仪器会自动绘制扩增曲线并判定为“阳性”；若无扩增曲线或荧光信号未超过阈值，则判定为“阴性”。

 试剂盒组成与操作流程

1. 典型试剂盒组成 (以48T规格为例)

反应干粉/液体：含有Bst DNA聚合酶、特异性引物、dNTPs、缓冲液等（部分产品为冻干粉，部分为液体）。

荧光染料/探针：用于显色。

阳性对照：含有PAT基因片段的质粒或DNA。

阴性对照：无核酸酶水。

缓冲液：如Reaction Buffer。

2. 操作步骤详解

第一步：样本前处理与DNA提取

样本类型：农作物植株、米粉、面粉、豆制品、饲料等。

DNA提取：使用配套的DNA提取试剂盒或快速裂解液处理样本，提取基因组DNA。注意避免DNA降解。

第二步：试剂准备 (冰上操作)

复溶：将冻干粉或冷冻的反应液在室温融化，轻微震荡混匀，并在离心机中瞬时离心。

配制反应体系：

在反应管中加入反应液、荧光染料。

分别加入待测样本DNA、阳性对照、阴性对照。

第三步：上机检测 (恒温扩增)

仪器设置：将反应管放入恒温荧光检测仪中。

反应条件：

温度：63℃ ± 1℃ (具体视说明书而定)。

时间：15 - 60分钟（通常为30-45分钟）。

荧光通道：选择FAM或SYBR Green通道进行实时监测。

第四步：结果分析

阳性判定：扩增曲线呈典型的“S”型，且荧光信号在规定时间内（如30分钟内）超过设定阈值。

阴性判定：无扩增曲线，荧光信号无明显变化（直线）。

无效判定：阳性对照未出现扩增曲线，或阴性对照出现扩增，提示试剂失效或操作污染，需重做。

 关键注意事项

防污染 (至关重要)：

分区操作：建议将实验分为样本制备区、试剂准备区和检测区。虽然恒温扩增速度快，但气溶胶污染风险依然存在。

一次性耗材：使用带滤芯的吸头，避免交叉污染。

废弃物处理：反应结束后，扩增管应置于密封袋中丢弃，禁止在实验区内开盖，以防气溶胶污染。

试剂保存与使用：

避光保存：荧光染料对光敏感，试剂盒应避光保存于-20℃或按说明书要求保存。

避免反复冻融：反复冻融会降低酶的活性，建议按单次使用量分装保存。

设备要求：

不需要昂贵的梯度PCR仪，只需具备恒温荧光检测功能的仪器（如LAMP仪、实时荧光恒温扩增仪）。

部分简易设备甚至可以使用水浴锅或金属浴配合便携式荧光检测器使用。

特异性与灵敏度：

恒温荧光法灵敏度极高（可检测低拷贝数基因），但对引物设计要求严格。该试剂盒通常针对PAT基因的特异性序列设计，能有效区分转基因与非转基因样本。

 总结

PAT基因检测试剂盒（恒温荧光法）是一种快速、灵敏、设备要求低的检测工具。它特别适合在基层检测机构、海关现场、农田或食品加工厂等不具备复杂实验室条件的场所，用于快速筛查样本中是否含有PAT基因（如转基因成分）。操作时请务必严格遵守防污染规范，以确保结果的准确性。

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