pCaMV35S基因检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

该试剂盒基于 TaqMan 荧光探针法（Real-time PCR）。

靶标识别： 针对 CaMV 35S 启动子的特异保守序列设计特异性引物和探针。

荧光信号： 反应体系中包含 FAM 荧光标记的探针。在 PCR 扩增过程中，随着目的基因片段的扩增，荧光探针被切断，释放出荧光信号。

实时监测： 仪器实时监测荧光信号的变化，通过扩增曲线和 Ct 值来判断样本中是否含有目标基因。

2. 检测目标与应用

目标基因： pCaMV35S（花椰菜花叶病毒 35S 启动子）。

应用领域：

转基因筛查： 用于大豆、玉米、油菜、棉花等农作物及其加工食品、饲料中转基因成分的定性检测。

科研用途： 用于分子生物学研究中，检测构建的载体或转基因植株中是否含有该启动子元件。

特异性： 该试剂盒通常能特异性区分 CaMV 35S 与同源性较高的 FMV 35S（玄参花叶病毒 35S 启动子）。

3. 试剂盒组成（典型配置）

根据常见品牌的配置，试剂盒通常包含以下组分：

组分名称 规格/含量 作用

A-CaMV35S-I (反应液) 1200μL × 1支 含 dNTPs、缓冲液、Mg2等

B-I (酶混合液) 55μL × 1支 含 HotStart Taq 酶、UNG酶（防污染）

阳性对照 (PG) 50μL × 1支 含 CaMV 35S 目标片段的质粒，用于验证实验

阴性对照 (NG) 50μL × 1支 无菌水，用于监控污染

注：部分厂家可能将酶和反应液预混，具体以说明书为准。

 4. 操作流程简述

样本制备： 提取待测样品的基因组 DNA（建议使用配套的植物基因组 DNA 提取试剂盒）。

试剂配制（冰上操作）： 按照说明书比例（如 N+2 法，N 为样本数，+1 阴性对照，+1 阳性对照）混合反应液和酶，分装到 PCR 管中。

加样： 向分装好的反应管中分别加入 2-5μL 的模板 DNA（样本、阴性对照、阳性对照）。

上机扩增： 将 PCR 管放入荧光定量 PCR 仪中。

5. 反应程序与结果判读

推荐反应程序：

预变性： 95℃ 10 min（或按说明书设置）。

PCR 循环： 95℃ 15 sec → 60℃ (或 63℃) 45 sec（收集荧光），40-45 个循环。

结果判读标准：

阳性（+）：

扩增曲线呈典型的 S 型。

Ct 值 ≤ 36（或说明书设定的阈值）。

结论：样品中含有 CaMV 35S 基因。

阴性（-）：

无 Ct 值，或 Ct 值 > 36（或无扩增曲线）。

结论：样品中不含有 CaMV 35S 基因或含量低于检测限。

可疑（±）：

Ct 值在 36-40 之间。建议重新检测，若复检 Ct 值 < 40 且曲线正常，判为阳性。

实验有效性：

阳性对照（PG）： 必须有明显扩增（Ct 值在预期范围内）。

阴性对照（NG）： 必须无扩增（无 Ct 值）。

若对照不符合要求，本次实验视为无效。

 6. 注意事项与局限性

防污染（重中之重）： PCR 检测极其灵敏，极易受气溶胶污染。严禁在检测区打开扩增后的 PCR 管盖。实验需分区（试剂准备区、样本制备区、扩增区）进行。

试剂保存： 试剂盒通常需在 -20℃ 条件下保存。运输和使用过程中应尽量避免反复冻融，以免影响酶活性。

避光操作： 反应液中的荧光染料对光敏感，配制体系时应尽量避光操作。

内标对照： 为了确保结果准确，每次检测都必须设置阳性和阴性对照。