PMI基因检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

PMI基因检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

试剂简介：

检测目标： 转基因作物中的 PMI 基因（常用于转基因玉米等）。

主要应用：

农作物检测： 转基因玉米及其制品的鉴定。

食品/饲料检测： 米粉、面粉、豆制品、婴幼儿辅食、植食性饲料等中的转基因成分筛查。

科研用途： 基因表达分析、质粒构建验证等。

检测方法： 实时荧光定量PCR（qPCR），采用TaqMan荧光探针法。

检测原理

该试剂盒基于双标记荧光探针（TaqMan Probe）技术：

特异性识别： 针对PMI基因的保守区域设计特异性引物和探针。

荧光信号： 探针的5'端标记荧光报告基团（通常为FAM），3'端标记荧光淬灭基团。

PCR扩增： 在PCR扩增过程中，Taq酶的5'→3'外切酶活性会切断与模板结合的探针，使报告基团与淬灭基团分离，从而释放出荧光信号。

定量分析： 荧光信号的强度与扩增产物的数量成正比，通过实时监测荧光信号的变化，实现对PMI基因的定性（定性检测）或定量（绝对定量拷贝数）检测。

试剂盒组成 (以48测试规格为例)

试剂盒内通常包含以下组分（具体以实际购买说明书为准）：

组分名称 规格/体积 保存条件 功能说明

PCR反应液 约15 μL/反应 -20℃避光 含dNTPs、缓冲液、Mg2、引物/探针

酶混合液 适量 -20℃ 含Hot Start Taq酶

阳性对照 (PC) 1管 -20℃ 含PMI基因片段的质粒或DNA

阴性对照 (NC) 1管 4℃或-20℃ 无菌双蒸水（Nuclease-free Water）

内参基因试剂 (可选) -20℃ 用于检测样本DNA提取质量（如内源基因）

 4. 操作流程详解

第一步：样本制备 (样本制备区)

样本类型： 植物组织（玉米叶/籽粒）、食品粉末、饲料等。

提取方法： 使用CTAB法或商业化植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。

要求： 提取的DNA应无色透明，无蛋白、多糖等杂质污染。

第二步：反应体系配制 (加样区)

计算： 根据样本数量计算所需反应管数（样本数 + 阳性对照 + 阴性对照）。

解冻： 将反应液和酶混合液从-20℃取出，在冰上解冻，涡旋混匀并瞬时离心。

分装： 按说明书比例将反应液与酶液混合，分装至PCR八联管或反应管中。

第三步：加样

向上述反应管中分别加入 5 μL 模板DNA。

样本管： 加入待测样本DNA。

阳性对照管： 加入阳性对照品。

阴性对照管： 加入阴性对照品（无菌水）。

注意： 加样过程需在冰上操作，加完后盖紧管盖，防止挥发和交叉污染。

第四步：PCR扩增 (扩增区)

仪器设置： ABI 7500、CFX96、Mx3005P、LineGene9600等实时荧光PCR仪。

荧光通道： 选择 FAM 通道（报告基团）。

反应程序（参考）：

预变性： 95℃ 2-5 min (1 cycle)

PCR扩增： 95℃ 15 sec → 60℃ 30-60 sec (40-45 cycles，于退火延伸步骤采集荧光)

第五步：结果分析

基线设定： 根据仪器噪声调整基线，通常取3-15个循环。

阈值设定： 阈值线应刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。

 5. 结果判定标准

有效实验标准：

阴性对照 (NC)： 无Ct值（或Ct值 > 40），无扩增曲线。

阳性对照 (PC)： Ct值 ≤ 36，且扩增曲线呈典型的“S”型。

若对照不符合上述标准，实验无效，需重做。

样本结果判定：

阳性 (+)： Ct值 ≤ 37，且扩增曲线呈明显的“S”型。表明样本中含有PMI基因。

阴性 (-)： Ct值 ≥ 40，或无Ct值，曲线为直线。表明样本中不含有PMI基因或含量低于检出限。

灰区 (可疑)： Ct值在 37-40之间。

建议：重新提取DNA或调整模板浓度复测。

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