z猪胸膜肺炎防线杆菌（APP）检测试剂盒（恒温荧光法） 新品

z猪胸膜肺炎防线杆菌（APP）检测试剂盒（恒温荧光法）

试剂简介：

检测原理与技术优势

技术名称： 恒温荧光法（通常为环介导等温扩增技术 LAMP，或重组酶聚合酶扩增 RPA）。

核心原理： 试剂盒针对APP的特异性保守序列（如 apxIVA 基因或 16S rRNA 基因）设计了多对特异性引物。在恒定温度（通常为60℃-65℃）下，利用链置换DNA聚合酶进行核酸扩增。

结果判读： 反应过程中会产生焦磷酸镁白色沉淀或荧光信号。通过观察反应管是否变浑浊（肉眼观察）或在荧光检测仪中读取荧光强度，即可判断样本中是否含有APP。

 试剂盒组成与保存

组分名称 主要功能 保存条件

反应液 (Rehydration Buffer) 含dNTPs、缓冲液、荧光染料（如SYTO-9或钙黄绿素） -20℃ 避光保存 (有效期通常12个月)

酶混合液 (Enzyme Mix) 含Bst DNA聚合酶（LAMP）或重组酶（RPA） -20℃ 保存 (严禁反复冻融)

阳性对照 (Positive Control) 含APP目的基因片段的质粒或灭活菌液 -20℃ 保存

阴性对照 (Negative Control) 无菌双蒸水或缓冲液 4℃ 保存

通用裂解液 (Lysis Buffer) 快速裂解细菌释放DNA (部分试剂盒包含) 室温或4℃

 适用样本与适用对象

样本类型：

病死猪/扑杀猪： 无菌采集肺脏、气管、肺门淋巴结、扁桃体等病变组织。

活体检测： 鼻腔拭子、咽拭子。

环境监测： 猪舍空气沉降菌、饮水样本。

适用对象：

养猪场兽医、动物疫病预防控制中心、科研院所。

适用于猪传染性胸膜肺炎的疑似病例确诊、带菌猪筛查及环境监测。

 标准操作流程 (恒温荧光法)

样本处理：

组织样本： 取0.5g-1g病变组织，加入1mL PBS缓冲液，研磨成匀浆，离心取上清。

拭子样本： 在1mL PBS中反复挤压洗脱，离心取上清。

细菌培养物： 直接取菌落悬浮于缓冲液中。

核酸提取（视试剂盒而定）：

快速法： 部分恒温荧光试剂盒支持“免提取”或“煮沸法”。即取200μL样本上清，100℃煮沸5-10分钟，离心后取上清作为模板。

试剂盒提取法： 使用配套的DNA提取试剂盒进行纯化。

体系配制：

在冰上解冻试剂。按比例将反应液、酶混合液混合，分装到PCR管中。

加样：

向反应管中加入5-10μL模板（或煮沸后的上清液）。

恒温扩增：

盖紧管盖，短暂离心。

放入恒温金属浴或荧光检测仪中，设置温度为 63℃ ± 1℃，反应 30-60分钟。

结果观察：

肉眼观察（浊度）： 阳性管液体浑浊（有白色沉淀），阴性管澄清透明。

紫外灯/荧光仪观察： 在紫外灯下或荧光仪中观察荧光强度。阳性管发出明显荧光（如绿色），阴性管无荧光。

 结果判读标准

阳性（+）：

反应曲线呈S型上升，且时间早于阳性对照（通常在15-30分钟内）。

或肉眼观察液体浑浊/荧光强烈。

表明样本中检测到APP核酸，猪群感染或携带该菌。

阴性（-）：

无扩增曲线，或反应时间晚于规定阈值（如>40分钟）。

或肉眼观察液体澄清/无荧光。

无效：

阳性对照无扩增（曲线平坦或无荧光）。

阴性对照出现扩增。

此时实验结果无效，需排查污染源或更换试剂重做。

 注意事项与生物安全

防污染： 恒温荧光法灵敏度极高，极易受气溶胶污染。加样时应使用带滤芯的吸头，且阳性对照应最后加入。

保存条件： 酶混合液对温度敏感，使用后应立即放回-20℃冰箱，避免在室温下长时间放置。

生物安全： 采集的病料和处理后的废液均应视为污染物，需按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行高压灭菌或化学消毒处理。

局限性： 恒温荧光法虽然速度快，但通常不如荧光定量PCR法易于实现多重检测（即同时检测多种病毒/细菌）。

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