埃博拉病毒(EBOV)检测试剂盒(荧光PCR法) 新品

埃博拉病毒是RNA病毒，因此检测试剂盒通常采用一步法荧光RT-PCR（逆转录-聚合酶链式反应）。

技术原理：

逆转录（RT）： 在逆转录酶的作用下，将样本中的病毒RNA反转录成cDNA。

PCR扩增： 利用特异性引物和探针（通常为TaqMan探针），对目标基因序列进行指数级扩增。

荧光检测： 在扩增过程中，探针被水解，释放出荧光信号。仪器实时监测荧光信号的增加，从而判断样本中是否存在病毒核酸。

检测类型：

定性检测： 判断样本中“有”或“无”埃博拉病毒。

定量检测： 通过标准曲线，计算出样本中病毒核酸的具体拷贝数（用于评估病毒载量）。

 试剂盒组成

以市面上常见的埃博拉病毒（扎伊尔型）核酸检测试剂盒为例，其主要成分通常包括：

组分名称 功能描述 注意事项

核酸提取试剂 用于从血清、血浆或全血中提取病毒RNA 需防止外源RNase污染

PCR反应液 含缓冲液、dNTPs、Mg2等 需-20℃保存，避免反复冻融

特异性引物/探针 针对埃博拉病毒NP基因或L基因的保守序列设计 决定检测的特异性

酶混合液 含逆转录酶和热启动DNA聚合酶 需在冰上操作，保持活性

阳性对照 含已知病毒RNA片段或质粒 极易污染，需单独存放，最后加样

阴性对照 不含病毒的溶液（如DEPC水） 用于监控试剂是否被污染

 适用样本与适用人群

样本类型：

人血清、血浆（最常用）。

全血（需抗凝处理）。

其他体液（在特定研究或尸检中）。

适用人群：

有埃博拉出血热疫区旅居史且出现发热、出血等症状的患者。

与埃博拉确诊或疑似病例有密切接触史的人员。

有病毒暴露风险的医护人员或实验室人员。

 标准操作流程

样本处理（样本制备区）：

采集患者血液样本，进行病毒灭活（通常在60℃以上处理一定时间）。

使用试剂盒提供的核酸提取试剂或商品化提取柱，提取病毒RNA。

反应体系配制（试剂准备区）：

将PCR反应液、酶混合液、引物探针按说明书比例混合。

分装到PCR反应管或八联管中。

加样：

将提取好的RNA模板、阴性对照、阳性对照各取一定体积（如5-10μL）加入反应体系中。

注意： 加样顺序应为：阴性对照 -> 样本 -> 阳性对照（且阳性对照应最后加，加完立即盖盖）。

上机扩增：

将PCR板放入荧光定量PCR仪。

设置反应程序（通常包括逆转录、预变性、以及40-45个循环的变性-退火-延伸）。

结果分析：

观察扩增曲线是否呈S型。

读取Ct值（循环阈值）。

 结果判读标准

阳性（+）： 扩增曲线呈典型的S型，且Ct值 ≤ 35（具体阈值依说明书而定），说明样本中检测到埃博拉病毒核酸。

阴性（-）： 无扩增曲线，或Ct值 ≥ 40。

灰区（可疑）： Ct值在35-40之间，建议重复实验。若复测仍为阳性或仍在此区间，需结合临床症状和其他检测结果综合判断。

无效： 阴性对照出现扩增（说明试剂污染），或阳性对照无扩增（说明试剂失效或操作失误），此次实验无效。

 生物安全与注意事项

生物安全等级： 埃博拉病毒属于生物安全四级（BSL-4）病原体。但在经过60℃以上有效灭活处理后的样本，可在生物安全二级（BSL-2）实验室进行核酸检测。

分区操作： 严格遵循PCR实验室分区原则（试剂准备区、样本制备区、PCR扩增区），各区的实验服、仪器、耗材应独立使用，不可混用。

防污染措施：

使用带滤芯的吸头。

阳性对照必须在单独区域操作，且不能与样本同时取出。

实验结束后，使用紫外线灯对实验室进行照射消毒。

试剂保存： 除阴性对照可能在4℃保存外，绝大多数组分（特别是酶和探针）需在-20℃避光保存。