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His标签纯化凝胶珠

品牌：MedChemExpress (MCE)

货号：HY-K0210

中文名称：His标签纯化凝胶珠（Ni-NTA）

存储条件：4°C，2年请勿干燥或冷冻琼脂糖珠。

产品活性：MCE His标签纯化凝胶珠 (Ni-NTA) 以高度交联的 6% 琼脂糖凝胶为基质，可实现高产量，高纯度的 His 标记蛋白的纯化。

生物活性：MCE His标签纯化凝胶珠 (Ni-NTA) 以高度交联的 6% 琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联了四配位的氮川三乙酸 (NTA)，螯合镍离子 (Ni2+) 后，可以形成非常稳定的八面体结构，更加稳定、高效。 本产品可以用于纯化细菌、哺乳动物细胞、昆虫及杆状病毒等表达的 His 标签重组蛋白。 本产品的规格与实际凝胶体积一致，凝胶含量为 50%。

描述及优势：

MCE His标签纯化凝胶珠 (Ni-NTA) 以高度交联的 6% 琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联了四配位的氮川三乙酸 (NTA)，螯合镍离子 (Ni²⁺) 后，可以形成非常稳定的八面体结构，更加稳定、高效。

本产品可以用于纯化细菌、哺乳动物细胞、昆虫及杆状病毒等表达的 His 标签重组蛋白。

本产品的规格与实际凝胶体积一致，凝胶含量为 50%。

操作流程：1. Buffer 的准备Lysis Buffer，Wash Buffer，Elution Buffer。注：根据不同的样品选择合适的 Buffer，也可根据自己的使用习惯配制不同的缓冲液体系，基本原则是“低咪唑上样，高咪唑洗脱”，或者“高 pH 上样，低 pH 洗脱”。Buffer 在使用前用 0.22 μm 或者 0.45 μm 滤膜过滤除菌。 2. 样品处理细菌或酵母表达的蛋白1) 挑取单菌落到培养基，根据载体使用说明加入相应浓度的诱导剂诱导相应的时间。2) 表达结束后，收集菌液至离心管中，7000 rpm，离心 15 分钟，弃上清，收集菌体沉淀。随后加入 1/10 体积的 Lysis Buffer 和蛋白酶抑制剂。加入溶菌酶 (工作液浓度为 0.2-0.4 mg/mL；如果表达的宿主细胞内含 pLysS 或 pLysE，可以不加溶菌酶)，需确认加入的蛋白酶抑制剂不会影响目的蛋白与 Agarose 的结合。3) 将菌体沉淀重悬混匀 (如果菌液浓度高，也可选择加入 10 μg/mL RNase A 和 5 μg/mL DNase I)，放置在冰上，然后冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。4) 将澄清的破碎液转移至离心管中，10000 rpm，4℃ 离心 20-30 分钟。取上清，置于冰上备用或 -20℃ 保存。酵母、昆虫和哺乳动物分泌表达可溶性蛋白1) 将细胞培养液收集至离心管中，5000 rpm，离心 10 分钟，取上清，弃沉淀，如上清中不含 EDTA、组氨酸和还原剂等物质，可直接加入柱子进行后续操作；如含有 EDTA、组氨酸和还原剂等物质，需用 1×PBS 在 4℃ 条件下经透析后才能加入柱子。2) 对于大量体积的上清，需加入硫酸铵沉淀浓缩后，用 1×PBS 在 4℃ 条件下经透析后才能加入柱子。包涵体蛋白 (变性条件)1) 将培养液收集至离心管中，7000 rpm，离心 15 分钟，弃上清，收集菌体沉淀。2) 按照菌体: Lysis Buffer=1:10 (W/V) 的比例将菌体重悬混匀，冰浴超声破碎。3) 将破碎液转移至离心管中，10000 rpm，4℃ 离心 20-30 分钟。弃上清，重复步骤 (2) 和步骤 (3) 一次。4) 按照菌体: Lysis Buffer (含 8 M 尿素)=1:10 (W/V) 的比例将包涵体悬浮起来。5) 变性条件下进行His标签重组蛋白纯化操作。3. Ni-NTA His-Tag Purification Agarose 的装填1) 用去离子水冲洗柱底筛板，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出 1-2 cm 的去离子水。2) 将 Agarose 悬浮混匀，小心地将浆液连续地倒入柱管中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。3) 打开柱底部出口，最初让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液压对所形成柱床的冲击，得到很好的装填效果。当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上 3 倍柱体积的去离子水。标记柱床高度。4) 关闭柱底部出口。4. 样品纯化1) 平衡：使用至少 5 倍柱体积的 Lysis Buffer 平衡层析柱。2) 上样：利用泵或注射器上样。为了避免堵塞层析柱，样品应经离心或使用滤膜 (0.22 μm 或 0.45 μm)过滤。3) 洗杂：用 Wash Buffer 冲洗柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线 (一般至少 10-15 倍柱体积)，收集流出组分和洗杂部分。注：在平衡缓冲液加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。 4) 洗脱：用 Elution Buffer 采用一步法或线性梯度洗脱。一步洗脱中，通常 5 倍柱体积洗脱液就足够了；线性梯度洗脱可以用一个小的梯度，例如 20 倍柱体积或更多，来分离不同结合强度的蛋白质。5) SDS-PAGE 检测：将纯化得到的样品 (包括流出组分、洗杂部分和洗脱部分)以及原始样品使用 SDS-PAGE 检测纯化效果。

详情参考：www.medchemexpress.cn/inhibitor-kit/ni-nta-his-tag-purification-agarose.html