板蓝根探针法PCR鉴定试剂盒

检测原理

采用TaqMan探针法实时荧光定量PCR技术：

探针设计：5'端标记荧光报告基团（如FAM），3'端标记淬灭基团，探针与靶基因特异性结合。

信号释放：PCR扩增时，Taq酶的5'→3'外切酶活性切割探针，分离报告基团与淬灭基团，释放荧光信号。

定量分析：通过荧光强度变化实时监测扩增进程，结合标准曲线对目标基因进行定量或定性检测。

产品组成

| 成分 | 规格 | 功能 |

| 探针法qRT-PCR缓冲液 | 500μL | 提供反应体系基础环境 |

| 探针法qRT-PCR酶混合液 | 100μL | 含逆转录酶、Taq酶等 |

| 板蓝根特异性引物混合液 | 100μL | 靶向板蓝根保守基因区域 |

| 荧光探针 | 50μL | 特异性结合扩增产物 |

| 阳性对照（1×10⁸拷贝/μL） | 50μL | 验证实验有效性 |

| 模板稀释液 | 1mL | 标准曲线制备用 |

实验步骤

1. 标准曲线制备

将阳性对照按10倍梯度稀释（10⁷~10²拷贝/μL），每个梯度设3复孔。

2. 样本处理

RNA提取：推荐使用柱式病毒RNA提取试剂盒，避免DNA污染。

阴性/阳性对照设置：以超纯水为阴性对照，稀释阳性对照为弱阳性对照（10³拷贝/μL）。

3. PCR反应体系（20μL）

| 组分 | 体积 |

| qRT-PCR缓冲液 | 10μL |

| 酶混合液 | 2μL |

| 引物混合液 | 2μL |

| 探针 | 1μL |

| 模板RNA | 5μL |

4. 反应程序

| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |

| 逆转录 | 50℃ | 30 min | 1 |

| 预变性 | 94℃ | 10 min | 1 |

| 扩增 | 94℃ | 15 sec | 40 |

| | 60℃ | 1 min（采集荧光） | |

数据分析

定量检测：以Ct值为纵轴，标准品log拷贝数为横轴绘制标准曲线，计算样本浓度。

定性检测：

阳性：Ct≤35，扩增曲线呈典型S型。

可疑：35<Ct<40，需复测。

阴性：Ct≥40或无扩增曲线。

注意事项

样本要求：RNA需避免反复冻融，提取后建议立即检测或保存于-80℃。

防污染措施：分设试剂配制区、样本处理区及扩增区，使用带滤芯枪头。

应用限制：仅限科研使用，不可用于临床诊断。

质量控制：每次实验需包含阴性对照和阳性对照，确保结果可靠性。

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