车前子探针法PCR鉴定试剂盒

检测原理

基于TaqMan探针法实时荧光定量PCR技术，针对车前子基因保守区设计特异性引物及探针。通过荧光信号累积实时监测扩增进程，结合标准曲线实现定性/定量分析，特异性强，灵敏度达10³拷贝/μL。

试剂盒组分

| 成分 | 规格 | 功能 |

| qPCR缓冲液 | 500μL/管 | 提供反应体系基础环境 |

| 酶混合液 | 50μL/管 | 含热启动Taq酶、逆转录酶|

| 引物-探针干粉 | 50T | 特异性扩增目标序列 |

| 阳性对照（人工DNA片段）| 50μL（10⁷拷贝/μL）| 标准曲线制备及质控 |

| 阴性对照（超纯水） | 50μL | 污染监测 |

实验步骤

样本处理：

使用商品化DNA提取试剂盒（推荐Hypure病毒基因组DNA提取试剂盒），避免交叉污染。

样本保存：短期-20℃，长期-70℃（避免反复冻融）。

标准曲线制备（定量检测需6个稀释梯度）：

阳性对照10倍梯度稀释（10⁷~10²拷贝/μL），每管加入5μL至反应体系。

反应体系配制（20μL/管）：

| 组分 | 体积 |

| qPCR缓冲液 | 10μL |

| 酶混合液 | 2μL |

| 引物-探针混合液 | 2μL |

| 模板DNA | 5μL |

PCR扩增程序：

逆转录：50℃ 30 min（RNA样本需此步骤）。

预变性：94℃ 10 min。

扩增循环（40次）：94℃ 15 sec → 60℃ 1 min（采集FAM通道信号）。

结果判读

定量分析：以Ct值为纵轴，标准曲线log值为横轴，计算样本浓度。

定性分析：

阳性：Ct值≤35，且扩增曲线呈S型。

阴性：Ct值≥40或无扩增曲线。

灰区（35<Ct<40）：需重复检测。

注意事项

防污染：分区操作（试剂配制、样本处理、扩增区），使用滤芯吸头及紫外消毒。

质控要求：

阴性对照Ct≥40，阳性对照Ct≤35。

若阳性质控异常，需排查试剂或仪器问题。

局限性：

基因突变可能导致假阴性；交叉污染或模板降解影响结果准确性。

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