欧洲放线菌探针法荧光定量PCR试剂盒 新品

欧洲放线菌探针法荧光定量PCR试剂盒

商品属性

检测原理

采用TaqMan探针法，探针5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。PCR扩增时，Taq DNA聚合酶的5'→3'外切酶活性切割探针，释放荧光信号，荧光强度与扩增产物量成正比，实现定量检测。

产品特点

高灵敏度：优化引物与探针，检测限低至10²拷贝/μL。

高特异性：针对Actinomyces europaeus保守序列设计，无交叉反应。

即开即用：预混反应液（含酶、dNTPs、缓冲液等），仅需添加模板DNA。

内控对照：提供无传染性的DN段作为阳性对照，避免假阴性。

适用范围：科研用途，适用于血清、血浆、组织匀浆、细菌培养物等样本。

操作流程

样本制备

DNA提取：

血清/血浆：3000 rpm离心10-30分钟，避免反复冻融。

组织匀浆：生理盐水匀浆后离心取上清。

细菌样本：推荐使用柱式DNA提取试剂盒。

DNA保存：分装后-20℃冻存，避免反复冻融。

标准曲线制备（以10²~10⁷拷贝/μL梯度为例）

标记6管，分别加入45 μL稀释液（DEPC-H₂O或专用缓冲液）。

取5 μL阳性对照（10⁸拷贝/μL）加入第1管，梯度稀释至10⁷~10²拷贝/μL，每步震荡混匀。

各浓度取5 μL进行qPCR，每个梯度重复3次。

qPCR反应体系

| 组分 | 体积（μL） |

| 预混Master Mix | 10 |

| 引物/探针混合液 | 2 |

| 模板DNA | 5 |

| DEPC-H₂O | 至20 |

反应条件

预变性：95℃ 5分钟

循环：95℃ 15秒 → 60℃ 1分钟（45循环，荧光采集）

注意事项

分区操作：样本制备、试剂配制、扩增需在独立区域进行，避免污染。

阳性对照处理：稀释需在专用区域完成，严禁接触其他组分。

数据判读：Ct值＞35需重复检测，标准曲线R²≥0.98方有效。

仪器校准：定期校验荧光通道灵敏度。

质量控制

阴性对照：DEPC-H₂O替代模板，应无扩增曲线。

重复性：同一样本Ct值变异系数（CV）＜5%。

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