地骨皮探针法PCR鉴定试剂盒

技术原理

本试剂盒基于实时荧光定量PCR（qPCR）探针法，通过以下步骤实现高特异性检测：

探针设计：5'端标记荧光报告基团（如FAM），3'端标记淬灭基团。当探针与靶序列结合时，Taq酶的5'核酸外切酶活性切割探针，释放荧光信号。

信号检测：荧光强度与扩增产物的量成正比，通过实时监测荧光信号实现定量分析。

产品特点

高灵敏度：可检测低至10 ng的DNA模板。

高特异性：引物及探针针对地骨皮高度保守区设计，避免交叉反应。

快速便捷：

即开即用，预混试剂减少操作步骤。

全程约3小时（含逆转录、扩增及检测）。

质控保障：提供阳性对照（1×10^8拷贝/μL）和阴性对照，区分假阴性/假阳性。

防污染设计：采用dUTP/UNG酶系统（部分型号）降低残留污染风险。

组分清单

| 成分 | 规格 | 功能 |

| 探针法qPCR缓冲液 | 500 μL | 反应体系基础液 |

| qPCR酶混合液 | 100 μL | 含Taq酶、逆转录酶等 |

| 地骨皮特异性引物混合液 | 100 μL | 靶序列扩增 |

| 地骨皮探针 | 50 μL | 荧光信号生成 |

| 阳性对照（1×10^8拷贝/μL） | 50 μL | 标准曲线制备 |

| 荧光PCR专用稀释液 | 1 mL | 模板稀释 |

操作步骤

1. 标准曲线制备（6个梯度稀释，10^2~10^7拷贝/μL）：

使用阳性对照和稀释液按10倍梯度稀释，冰上保存备用。

2. 样品RNA提取：

推荐使用柱式RNA提取试剂盒，设置阴性/阳性对照。

3. qPCR反应体系（20 μL）：

| 组分 | 体积（μL） |

| qPCR缓冲液 | 10 |

| 酶混合液 | 2 |

| 探针 | 1 |

| 引物混合液 | 2 |

| 模板RNA | 5 |

4. 扩增程序：

逆转录：50℃ 30 min

预变性：94℃ 10 min

扩增循环（40次）：94℃ 15 sec → 60℃ 1 min（采集FAM信号）

结果分析

定量分析：以标准曲线log值为横轴、Ct值为纵轴，计算样本浓度。

定性判断：

阳性：Ct≤35，明显扩增曲线。

可疑：35<Ct<40，需复测确认。

阴性：Ct≥40或无扩增。

注意事项

储存与运输：-20℃避光保存，避免反复冻融。

污染控制：分区操作（样品制备区、扩增区），使用带滤芯枪头。

实验无效标准：

阳性对照Ct>35或阴性对照出现扩增。

假阳性/假阴性风险提示：

避免RNA降解或交叉污染。

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