蒲公英探针法PCR鉴定试剂盒

检测原理

基于实时荧光定量PCR（qPCR）技术，通过探针法特异性检测蒲公英核酸序列：

探针设计：5'端标记荧光报告基团（如FAM），3'端标记淬灭基团。当探针完整时，荧光信号被淬灭；PCR扩增时，Taq酶的5'→3'外切酶活性切割探针，释放荧光信号。

定量分析：通过循环阈值（Ct值）与标准曲线比对，实现模板的绝对定量；定性分析则依据Ct值判断阳性/阴性。

产品组成

| 成分 | 规格/功能说明 |

| qRT-PCR缓冲液 | 500μL（提供反应体系基础环境） |

| 酶混合液 | 100μL（含逆转录酶、Taq DNA聚合酶等） |

| 引物混合液 | 100μL（特异性扩增蒲公英保守区序列） |

| 荧光探针 | 50μL（标记FAM/BHQ1等荧光基团） |

| 阳性对照 | 50μL（1×10^8拷贝/μL，无传染性DNA片段）|

| 模板稀释液 | 1mL（用于标准曲线制备） |

实验步骤

1. 标准曲线制备（定量检测需6个梯度稀释）

阳性对照依次10倍稀释（10^2~10^7拷贝/μL），独立操作避免污染。

2. 样本RNA提取

推荐使用柱式病毒RNA提取试剂盒，设置阴性/阳性对照（N+2样本）。

3. qPCR反应体系（以20μL为例）

| 成分 | 样品管（μL） | 阴性对照（μL） | 标准曲线管（μL） |

| qRT-PCR缓冲液 | 10 | 10 | 10 |

| 酶混合液 | 2 | 2 | 2 |

| 引物混合液 | 2 | 2 | 2 |

| 荧光探针 | 1 | 1 | 1 |

| 样本RNA | 5 | — | — |

| 超纯水 | — | 5 | — |

| 标准品稀释液 | — | — | 5 |

4. 反应程序

| 步骤 | 温度 | 时间 |

| 逆转录 | 50℃ | 30 min |

| 预变性 | 94℃ | 10 min |

| 扩增（40循环） | 94℃ 15 sec → 60℃ 1 min（采集荧光） |

结果判读

定量分析：以标准曲线log值为横轴，Ct值为纵轴，计算样本拷贝数。

定性分析：

阳性：Ct ≤ 35，扩增曲线呈S型；

阴性：Ct ≥ 40或无扩增；

可疑（35<Ct<40）：需复测确认。

注意事项

防污染：分区操作（样本制备、PCR配制、扩增区），使用带滤芯枪头。

质量控制：每批次实验需包含阴/阳性对照，否则数据无效。

适用范围：仅限科研使用，不可用于临床诊断。

重复性建议：定量实验至少3次技术重复，确保数据可靠性。

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