忍冬藤探针法PCR鉴定试剂盒

技术原理

基于实时荧光定量PCR（qPCR）技术，采用探针法检测原理：

探针设计：5'端标记荧光报告基团（如FAM），3'端标记淬灭基团，探针与靶序列结合后，Taq酶在扩增过程中切割探针，释放荧光信号。

定量分析：通过监测荧光强度增长（Ct值）实现靶序列的定性和定量检测。

高特异性：引物及探针针对忍冬藤高度保守区设计，避免交叉反应。

试剂盒组成

| 成分 | 规格/功能说明 |

| qRT-PCR缓冲液 | 500μL（提供反应体系基础环境） |

| qRT-PCR酶混合液 | 100μL（含逆转录酶及Taq酶） |

| 荧光模板稀释液 | 1 mL（用于标准曲线稀释） |

| 引物混合液 | 100μL（特异性扩增忍冬藤序列） |

| 探针 | 50μL（标记荧光基团） |

| 阳性对照（无传染性）| 50μL（1×10⁸拷贝/μL DNA片段） |

| 说明书 | 1份 |

实验步骤

1. 标准曲线制备（6个梯度稀释）

使用阳性对照按10倍梯度稀释（10⁷~10²拷贝/μL），独立操作避免污染。

2. 样本RNA提取

建议设置阴性（NC）和阳性对照（PC），推荐配套RNA提取试剂盒。

3. qRT-PCR反应体系（20μL）

| 成分 | 体积（μL） |

| 缓冲液 | 10 |

| 酶混合液 | 2 |

| 探针 | 1 |

| 引物混合液 | 2 |

| 模板RNA/标准品/水 | 5 |

4. 反应程序

逆转录：50℃ 30 min

预变性：94℃ 10 min

扩增（40循环）：94℃ 15 sec → 60℃ 1 min（采集FAM信号）

数据分析

定量检测：以标准曲线log值为横轴、Ct值为纵轴，计算样本浓度。

定性判定：

阳性：Ct≤35（有明显扩增曲线）；

阴性：Ct≥40；

灰区（35<Ct<40）：需复检。

注意事项

操作规范：分区分步骤操作（样本处理、试剂配制、加样），避免交叉污染。

保存条件：-20℃避光保存，避免反复冻融。

质量控制：每次实验需包含阴/阳性对照，确保结果可靠性。

废弃物处理：实验后使用10%次氯酸或75%乙醇消毒台面及器材。

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