桃仁探针法PCR鉴定试剂盒

技术原理

基于实时荧光定量PCR（qPCR）探针法：

探针设计：5'端标记荧光报告基团，3'端标记淬灭基团。Taq酶在扩增时切割探针，释放荧光信号，实现靶序列特异性检测。

高特异性：引物及探针针对Semen persicae保守序列设计，经生物信息学验证，交叉反应风险极低。

灵敏度：最低检测限达10³拷贝/μL，无需增菌步骤。

试剂盒组成

核心组分：

qPCR缓冲液

逆转录酶混合液

桃仁特异性引物及探针混合液

阳性对照（1×10⁸拷贝/μL，无传染性DNA片段）

模板稀释液

自备材料：RNA提取试剂、无核酶耗材、荧光定量PCR仪（需支持FAM通道）。

操作流程

1. 实验分区要求

三区分离：试剂准备区、样本处理区（需生物安全柜）、扩增区。各区仪器、耗材独立，紫外线消毒。

防污染措施：使用带滤芯吸头，避免裸手接触反应管。

2. 标准曲线制备（定量分析）

将阳性对照按10倍梯度稀释（10²~10⁷拷贝/μL），分装至标记离心管。

3. RNA提取

采用兼容的RNA提取试剂盒，建议设置阴/阳性提取对照。

4. qPCR反应体系（20μL）

| 成分 | 体积（μL） |

| qPCR缓冲液 | 10 |

| 酶混合液 | 2 |

| 引物混合液 | 2 |

| 探针 | 1 |

| 模板RNA/标准品/对照 | 5 |

5. 扩增参数

逆转录：50℃ 30 min

预变性：94℃ 10 min

扩增循环（40次）：94℃ 15 sec → 60℃ 1 min（采集FAM信号）

数据分析

定量检测：以Ct值为纵轴，标准品log浓度为横轴绘制曲线，计算样本浓度。

定性判定：

阳性：Ct ≤ 35，扩增曲线呈典型S型。

可疑（35 < Ct < 40）：需复测确认。

阴性：Ct ≥ 40或无扩增。

注意事项

防污染：实验全程使用无核酶耗材，避免RNA降解。

批次一致性：不同批号试剂不可混用。

仪器设置：ABI系列仪器需关闭ROX校正，淬灭基因选None。

废弃物处理：实验废弃物需经无害化处理后再丢弃。

性能参数

特异性：100%（经40+近缘种验证，无非特异扩增）。

重现性：100%（批内/批间差异可控）。

检测范围：覆盖桃仁特异性基因序列，3-4小时完成检测。

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