凌霄花探针法PCR鉴定试剂盒

凌霄花探针法PCR鉴定试剂盒

商品属性

技术原理

基于实时荧光定量PCR（qPCR）探针法：

探针设计：5'端标记荧光报告基团，3'端标记淬灭基团。当探针完整时，荧光信号被淬灭；PCR扩增时，Taq酶的5'→3'外切酶活性切割探针，释放报告基团荧光信号。

定量分析：通过监测荧光信号增长（FAM通道），实时计算Ct值，实现对目标序列的定性和定量检测。

产品组成

| 成分 | 规格/含量 |

| 探针法qPCR缓冲液 | 500μL |

| qPCR酶混合液 | 100μL |

| 荧光PCR模板稀释液 | 1mL |

| 凌霄花特异性引物混合液 | 100μL |

| 凌霄花探针 | 50μL |

| 阳性对照（1×10⁸拷贝/μL） | 50μL |

| 说明书 | 1份 |

实验步骤

1. 标准曲线制备（以10²~10⁷拷贝/μL梯度为例）

标记离心管（7~2号），依次用稀释液将阳性对照进行10倍梯度稀释。

每步需更换枪头，冰上保存备用。

2. 样本RNA提取

推荐使用柱式病毒RNA提取试剂盒，或兼容的RNA纯化方法。

设置阴性对照（NC，水）和阳性对照（PC，稀释阳性模板）。

3. qPCR反应体系（20μL）

| 成分 | 样品管（μL） | 阴性对照（μL） | 标准曲线管（μL） |

| qPCR缓冲液 | 10 | 10 | 10 |

| 酶混合液 | 2 | 2 | 2 |

| 探针 | 1 | 1 | 1 |

| 引物混合液 | 2 | 2 | 2 |

| 样本RNA/标准品 | 5 | - | 5（对应梯度） |

| 超纯水 | - | 5 | - |

4. 反应程序

| 步骤 | 温度 | 时间 |

| 逆转录 | 50℃ | 30 min |

| 预变性 | 94℃ | 10 min |

| 扩增（40循环） | 94℃ 15 sec → 60℃ 1 min（采集荧光） |

数据分析

定量检测：以阳性对照log浓度为横轴、Ct值为纵轴绘制标准曲线，推算样本浓度。

定性检测：

阳性：Ct≤35，扩增曲线明显。

可疑：35<Ct<40，需复测确认。

阴性：Ct≥40或无扩增。

注意事项

分区操作：试剂准备区、样本处理区、扩增区需物理隔离，避免污染。

探针避光：避免裸手接触PCR管，防止荧光淬灭。

质量控制：每批次实验需包含阴/阳性对照，且阳性质控Ct≤35，阴性质控Ct≥40。

禁止反复冻融：试剂开封后建议分装保存。

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