细辛探针法PCR鉴定试剂盒

技术原理

基于实时荧光定量PCR（qPCR）探针法：

探针设计：5'端标记荧光报告基团（如FAM），3'端标记淬灭基团，靶序列扩增时Taq酶切割探针，释放荧光信号。

定量分析：通过荧光强度增长实时监测扩增产物，结合标准曲线计算模板初始浓度。

产品组分

| 成分 | 规格 | 功能 |

| 探针法qRT-PCR缓冲液 | 500μL | 提供反应体系基础环境 |

| 探针法qRT-PCR酶混合液 | 100μL | 含逆转录酶及Taq酶 |

| 荧光PCR专用模板稀释液 | 1 mL | 标准品稀释 |

| 细辛特异性引物混合液 | 100μL | 靶序列扩增 |

| 细辛qPCR探针 | 50μL | 荧光信号标记 |

| 阳性对照（1×10⁸拷贝/μL） | 50μL | 标准曲线制备 |

| 说明书 | 1份 | 操作指南 |

操作步骤

1. 标准曲线制备（样本制备区）

将阳性对照按10倍梯度稀释（10⁷~10²拷贝/μL），标记离心管（7~2号），每步换枪头避免污染。

2. 样本RNA提取

建议设置阴性对照（NC，水）和阳性对照（PC，稀释阳性模板）。

兼容多数RNA提取试剂，推荐柱式纯化法。

3. qPCR反应体系配制（试剂准备区）

按以下比例配制（20μL/管）：

缓冲液：10μL

酶混合液：2μL

探针：1μL

引物混合液：2μL

模板：5μL（样本/标准品/阴性对照）

4. 扩增程序（扩增区）

| 步骤 | 温度 | 时间 |

| 逆转录 | 50℃ | 30 min |

| 预变性 | 94℃ | 10 min |

| 40循环 | 94℃ 15 sec → 60℃ 1 min（采集FAM信号） |

数据分析

定量检测：以阳性对照log浓度为横轴、Ct值为纵轴绘制标准曲线，计算样本浓度。

定性检测：

阳性：Ct≤35，典型扩增曲线；

阴性：Ct≥40或无扩增；

可疑（35<Ct<40）：需复测确认。

注意事项

分区操作：样本制备、试剂配制、扩增需独立区域，避免交叉污染。

质量控制：每次实验需包含阴/阳性对照。

防污染措施：使用带芯枪头、紫外消毒台面及移液器。

储存：组分使用前短暂离心混匀，避免反复冻融。

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