ERK1／2抑制剂PD98059;PD 98059;PD98059;PD-98059

SIGMA P215-1MG  PD 98059; P215-5MG

五洲元业特别提醒：注意该试剂现用现配，否则会有结晶析出。

采用Ficoll-Paque淋巴细胞分离液分离成人MSC ,体外扩增 ,应用地塞米松、β -甘油磷酸钠、vitaminC定向诱导MSC分化为成骨细胞。在成骨诱导液中加入不同剂量的PD980 59,观察其对成骨细胞形成的影响。结果 :MSC体外扩增 1 5代可获得 (3 - 4 )× 1 0 1 2 个细胞。

目的 :探讨胞外信号调节激酶 (ERK)信号传导途径对骨髓间质干细胞 (MSC)分化为成骨细胞的影响。方法 :采用Ficoll-Paque淋巴细胞分离液分离成人MSC ,体外扩增 ,应用地塞米松、β -甘油磷酸钠、vitaminC定向诱导MSC分化为成骨细胞。在成骨诱导液中加入不同剂量的PD980 59,观察其对成骨细胞形成的影响。结果 :MSC体外扩增 1 5代可获得 (3 - 4 )× 1 0 1 2 个细胞。在成骨诱导液作用下 ,MSC可在体外定向分化为成骨细胞。不同剂量的PD980 59均可抑制MSC分化为成骨细胞 ,并有剂量依赖关系 ;同时促使部分细胞转化为脂肪细胞。结论 :ERK信

细胞外信号调节激酶(ERK)级联是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路中的重要一员，与细胞增殖、分化、凋亡关系密切[1]。乙型肝炎病毒(HBV)x(HBx)基因是一种致肝癌的重要因子，能激活肝细胞内ERK通路，从而影响细胞生物学特性[2，3]。本实验通过稳定表达HBx的HepG2细胞(HBx+ HepG2)对顺铂以及顺铂联合MAPK/ERK激酶(MEK)特异性抑制剂PD98059敏感性差异的研究，探讨PD98059提高HBx+HepG2对顺铂敏感性的作用机制。
一、材料与方法
1. 质粒、细菌及细胞株：质粒pCP10由北京解放军第三0二医院传染病研究所成军教授惠赠，内含两拷贝的HBV ayw亚型全长基因组序列；pcDNA3真核表达载体购于美国Stratagene公司；感受态菌株由郑州大学消化疾病研究所自制；人肝癌细胞株HepG2购于中国科学院上海细胞生物研究所；宿主菌E.coli JM109由郑州大学消化疾病研究所保存。
2. 主要试剂：质粒抽提试剂盒、凝胶纯化试剂盒为美国Promega公司产品；核酸内切酶EcoRⅠ、HindⅢ购自大连宝生物公司；转染试剂盒Lipofectamine plus为美国Invitrogen公司产品；超纯质粒抽提试剂盒购自武汉Vata-gene公司；RNA抽提试剂盒为德国Qiagen公司产品；鼠抗人单克隆抗体p-ERK1/2、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、二氨基联苯胺(DAB)均购自北京中山生物技术有限公司；PD98059为美国Sigma公司产品。引物合成和DNA测序分别由上海生工生物工程公司、北京赛百胜生物技术公司完成。
3. 引物设计：应用Oligo引物设计软件，以HBx基因的开放读码框(ORF)为目的片段设计巢式聚合酶链反应(PCR)引物，于内引物5′端分别加入EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点及保护碱基，其引物序列上游：5′-CGGAAGCTTATGGCTGCT AGGCTGTGCTG-3′，下游：5′-CGGAATTCTTAGGCA GAGGTGAAAAAGT-3′，扩增产物长度482bp；外引物序列上游：5′-TGCGTTGATGCCTTTGTATG-3′，下游：5′-AGAATTGCTTGCCTGAGTGC-3′，扩增产物长度1034bp。
4. 载体的构建和鉴定：将HBx的PCR扩增产物和pcDNA3均进行EcoRⅠ、HindⅢ双酶切，目的片段行凝胶回收，载体和靶片段(1:5)用T4连接酶连接，转化大肠杆菌，小量制备表达载体pcDNA3-HBx。将重组质粒进行EcoRⅠ、HindⅢ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段是否存在，并将重组质粒进行DNA测序。
5. 质粒的体外转染和阳性细胞的筛选：转染前1d于24孔板中接种约70%孔底面积的HepG2，24h后转染，同时设空质粒组和脂质体组。含G418培养基筛选阳性克隆，以500μg/ml的浓度筛选2周，待对照组细胞全部死亡后，将浓度降至200μg/ml维持筛选。挑取阳性克隆扩大培养，抽提细胞RNA进行RT-PCR，鉴定HBx-ORF是否存在。
6. Western blot检测各组细胞中磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的表达情况：收集1×107个细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，4℃ 12000r/min离心5min，收集沉淀。加入预冷的裂解液30μl，吹打均匀，4℃ 10 000r/min离心2min，吸上清液准备上样或-80℃保存。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后电转印于聚偏氟乙烯膜上。封闭液室温封闭1h；分别加入抗体(1:100)与第二抗体(1:1000)，37℃孵育1h；DAB显色。
7. 四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞对顺铂的敏感性：分别将阳性组细胞、空质粒组细胞、脂质体组细胞消化为单细胞悬液，以1×104/孔接种于96孔板，待其完全贴壁后，先用无血清、无抗菌素培养基培养过夜使其同步化。然后每孔加入含2μg/ml顺铂的DMEM，继续培养24h。阳性细胞另设一组，在加入顺铂前，先用含100μmol/L PD98059的培养基孵育2h，再加入相同浓度顺铂进行孵育。每组均设正常对照及空白对照组。继续培养24h，按MTT法测530nm处吸光度值(A)。抑制率(IR)=(1－加药孔A值/对照孔A值)×100%。
8. 统计学分析：用SPSS10.0软件进行单因素方差分析。
二、结果
1. 表达载体的鉴定：对pcDNA3-HBx行双酶切，得到含粘性末端的HBx-ORF片段，长475bp(图1)。测序结果显示，插入片段与质粒中HBx-ORF基因100%同源。
2. 转基因细胞的筛选：对转染pcDNA3-HBx的HepG2经G418筛选3～4周后分别挑选抗性克隆，RT-PCR检测HBx-ORF mRNA。结果显示阳性细胞中存在目的片段，长485bp(图2)。
3. 各组细胞p-ERK1/2的表达：HBx+细胞p-ERK1/2的表达明显强于空质粒组细胞和脂质体组细胞(ERK1为4.4×104，ERK2为4.2×104)，见图3。
4. 各组细胞对顺铂的敏感性：顺铂对HBx+细胞抑制率明显低于空质粒组和脂质体组(P<0.01)。而先用PD98059孵育的HBx+细胞，顺铂对其抑制率显著上升(表1)。
表1  顺铂对各组细胞的抑制率(x-±s)
组别 样本数  抑制率(%)
脂质体组 9 32.51±2.49*
空载体组 9 30.18±3.24*
HBx+组 9 20.23±1.98
PD98059组 9 31.20±3.26*
　　与HBx+组相比，* P<0.01
三、讨论
ERK1/2通过其上游的激酶MEK1/2，及其激酶的激酶Raf逐级磷酸化，最终激活自身的苏氨酸、酪氨酸激酶而活化[4]。激活的ERK移位到细胞核，磷酸化一系列转录因子，从而激活一些基因的转录，导致细胞增殖和抑制细胞凋亡，其最终结果与肿瘤的恶性演变相关[5，6]。
X蛋白(pX)是HBV 4个ORF中X-ORF编码的一种病毒蛋白，是诱发肝细胞癌的重要因子。研究发现，能被pX激活的转录因子有核因子-κB、AP-1、AP-2和SP-1等，而pX是通过激活ERKs、JNKs、MAP和Ras-Raf-MAP等酶联信号系统来激活转录因子的表达。癌基因和原癌基因被激活后，可激发相应的致癌效应。
本实验通过对稳定表达HBx的HepG2细胞的研究，发现HBx可以激活细胞内的ERK通路，从而降低HepG2对顺铂的敏感性。而以PD98059阻断ERK的激活之后，HBx+ HepG2对顺铂的敏感性恢复至正常HepG2的水平。从而为确定一个肝癌辅助治疗靶点，提高乙型肝炎后肝癌化学治疗的效果提供理论基础。