镍(Ni)ELISA试剂盒

镍(Ni)ELISA试剂盒

简介 

镍是人体必需的生命元素，在人体内含量极微，正常情况下，成人体内含镍约10mg，血液中正常浓度为0.11μgNi. ml-1。人体对镍的日需要量为0.3mg。镍缺乏可引起糖尿病、贫血、肝硬化、尿毒症、肾衰、肝脂质和磷脂质代谢异常等病症。镍同时也是最常见的致敏性金属，约有20%左右的人对镍离子过敏，过敏人群中女性患者人数高于男性患者，在与人体接触时，镍离子可以通过毛孔和皮脂腺渗透到皮肤里面去，从而引起皮肤过敏发炎，其临床表现为瘙痒、丘疹性或丘疹水泡性皮炎和湿疹，伴有苔藓化。一旦出现致敏症状，镍过敏能无限期持续。更为严重的是因镍摄入过多而导致的中毒现象。人体每天摄入可溶性镍250mg则会引起中毒，特有症状是皮肤炎、呼吸器官障碍及呼吸道癌症。

酶联免疫分析法是检测重金属离子的一种新方法，与传统检测方法相比，该方法省时、便携、易操作，适用于重金属离子的现场快速检测，具有操作简单、检测时间短的特点，适用于各类企业、检测机构、监督部门对重金属镍超标的现场快速检测。

检测原理 

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中镍和微孔条上预包被的偶联抗原竞争镍抗体，加入酶标二抗后，形成包被抗原-抗体-酶标二抗复合物。随后结合的酶催化TMB底物显色，样本吸光值与其含有的镍成负相关。通过标准曲线可准确定量样品中镍的含量。通过标准曲线计算所得值乘以样品处理的稀释倍数即为实际样品中镍的含量。

间接竞争法模式

按操作顺序形成包被抗原-抗体-酶标二抗复合物后，加入TMB 底物，板孔液体由无色变成蓝色，再加入终止液液体变为黄色后进行吸光度值测定。

 检测实验的局限性

1. 试剂盒的使用期限不得超过试剂盒标签上的有效期。不要将试剂与其他批次或来源的试剂混合使用或替换使用。

2. 如果样品产生的值高于最高标准，则用测定稀释剂进一步稀释样品，并重复测定。稀释剂、操作人员、移液技术、洗涤技术、培养时间或温度以及试剂盒使用年限的任何变化都可能导致结合变化。

3. 样本采集、处理和存储的变化可能会导致样本值的差异。

4. 本试剂盒实验设计消除了不同样品中可能潜在的干扰因素的影响，但并不能涵盖所有潜在影响因素。不能排除存在其他干扰的可能性。

操作要点 

1. 为了避免交叉污染，在添加每个标准品、样品和试剂时应更换移液器枪头。

2. 当使用自动洗板机时，在加入洗涤缓冲液后加入30秒的浸泡期，或者在洗涤步骤之间将板旋转180度，可以提高测定精度。

3. 显色剂应保持无色，直到添加到板中。确保显色剂不受光线照射。

4. 应按照与显色剂相同的顺序将终止液添加到板中。加入终止液后，孔中形成的颜色将从蓝色变为黄色。蓝色的孔表示终止液未与溶液充分混合。

需要的其他材料

1. 酶标仪，包含450nm测定波长，同时包含600-680nm校正波长更佳；

2. 移液器及枪头；

3. 蒸馏水或去离子水；

4. 100-1000mL刻度量筒；

5. 洗瓶、排枪或自动微孔板清洗机；

6. 水平轨道微孔板振荡器，能够保持500±50 rpm的速度；

7. 用于稀释标准品和样品的试管。

注意事项

1. 此试剂盒提供的终止液为稀硫酸溶液，具有一定腐蚀性，应谨慎操作。

2. 该试剂盒中的某些成分含有防腐剂，可能会引起皮肤过敏反应，应佩带口罩避免吸入薄雾。

3. 显色剂B可能会引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激，应佩带口罩避免吸入薄雾。

4. 佩戴防护手套、防护服、眼睛和面部防护用品。处理后彻底洗手。

试剂准备

使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟左右。

洗涤液/稀释液配制：试剂盒中取出标准品，准备7个试管，先将6000 ppb标准品（200µL）按需吸取一定量用1×稀释液稀释至3200 ppb（例：533µL的标准品母液+467 µL的1×稀释液，制备得到1000μL的3200 ppb浓度标准品），随后在6个试管中分别加入500μL的1×稀释液，在这6个单独的试管中将3200 ppb标准品依次 2 倍倍比稀释至7个梯度，共配制7个浓度的标准品，依次为：3200 ppb、1600 ppb、800 ppb、400 ppb、200 ppb、100 ppb、50 ppb，从最高浓度标准品溶液中吸取500μL标准品到下一个试管中，轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释（如图所示），1×稀释液用作零浓度标准品(0ppb/mL)。

 一抗工作液配制：

使用前10分钟，用1×稀释液将100×一抗工作液稀释成1×一抗工作液，根据所需用量配置。

酶标二抗工作液配制：

使用前10分钟，用1×稀释液将100×酶标二抗稀释成1×酶标抗体工作液，根据所需用量配置。

备注 ： 如样本中待测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况选择适当的稀释倍数 (建议：将待测样本用样品稀释液最低稀释1倍，在正式实验之前做预实验，以确定具体稀释倍数) ；标准品母液及100×酶标二抗溶液根据实验所需酶标板孔数吸取一定量配制工作液，剩余溶液应放回-20℃储存，且避免反复冻融。（若实验在1-2周内做完，标准品母液及100×酶标抗体置于2-8℃保存；若实验为长时间跨度实验，建议将标准品母液及100×酶标抗体置于-20℃保存，以保证实验结果的稳定性）

实验步骤

所有标准品、样品建议复孔检测

1. 样本孵育：每孔分别加入50μL不同浓度的标准品/预处理过的待测样品，同时加入抗试剂50µL/孔（加抗试剂时请使用多道移液器），盖上封板膜在37℃下孵育30分钟。孵育结束后，每孔加入300μL 1×洗涤缓冲液，轻轻晃动30秒，甩干并在纸上拍干，以这种方式清洗3次。

2. 二抗孵育：每孔加入100μL酶标抗体工作液，轻轻混匀，盖上封板膜在37℃下避光孵育30分钟。孵育结束后，重复步骤1中的清洗方式清洗4次。

3. 底物显色：每孔首先加入50μL显色液A，随后加入50μL显色液B，轻轻混匀，盖上封板膜在37℃下避光孵育15分钟。（加显色液时请使用多道移液器，根据样品和对照抗体的颜色，自行控制显色时间）

4. 终止反应：待显色反应结束后，每孔加入50μL终止液（加终止液时请使用多道移液器），轻轻混匀，5分钟内用预热完成的酶标仪在450nm处测吸光值。

实验步骤汇总

1. 加标准品/样品和一抗，37℃反应30分钟，洗涤3次。

2. 加酶标二抗，37℃反应30分钟，洗涤4次。

3. 加显色液，37℃避光反应15分钟。

4. 加终止液，在5分钟内读数。

精密度

批内精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在同一个板块内精度评估。

批内变异系数 CV%小于10%。

批间精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在不同板块内精度评估。

批间变异系数 CV%小于15%。

回收率

样本回收率：80%-120%

灵敏度 

经样本测试，本试剂盒的检测灵敏度为50 ppb。

线性关系

校准品剂量反应曲线相关系数r值，大于等于0.996。

交叉反应性

镍：百分之百

本试剂盒由上海酶联生物公司提供，镍(Ni)ELISA试剂盒相关的实验曲线数据请下载本产品说明书。