鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)检测方法(荧光PCR法)

鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)检测方法(荧光PCR法)

试剂简介：

鳜鱼传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）是一种严重危害鳜鱼养殖业的病毒，荧光PCR法因其高灵敏度和特异性而成为检测ISKNV的常用方法。以下是该检测方法的详解说明及操作特点：

检测原理

基于实时荧光定量PCR技术，利用特异性引物和TaqMan探针靶向扩增ISKNV基因组中的保守区域（如major capsid protein基因）。在PCR扩增过程中，

探针与目标序列结合并被Taq酶降解，释放荧光信号。通过实时监测荧光强度变化，实现对ISKNV核酸的高灵敏度和高特异性检测。

试剂盒组成

PCR反应液：含缓冲液、dNTPs、Mg2?等基础成分

热启动DNA聚合酶：用于DNA扩增

特异性引物和探针：针对ISKNV保守基因区域设计，探针带荧光报告基团（如FAM）和淬灭基团（如TAMRA）

阳性对照：含已知浓度的ISKNV DNA

阴性对照：无菌去离子水或不含病毒DNA的样本

DNA提取试剂：用于从样本中提取病毒DNA

操作步骤

样本采集与处理：采集鳜鱼的脾脏、肾脏等组织样本，进行匀浆、离心等预处理。

核酸提取：使用试剂盒提供的提取试剂或自动化核酸提取仪，从样本中提取病毒DNA。

反应体系配置：在冰浴中混合PCR反应液、引物/探针、模板DNA，并设置阳性和阴性对照。

荧光PCR扩增：将反应体系置于荧光定量PCR仪中，执行扩增程序（如95℃预变性5分钟，40个循环：95℃ 15秒、60℃ 1分钟），实时监测荧光信号。

结果分析：根据Ct值和扩增曲线判定结果（如Ct≤35为阳性，Ct≥40为阴性）。

操作特点

高灵敏度与特异性：可检测低至10拷贝的病毒核酸，有效避免假阴性；特异性引物和探针设计，避免与其他病毒交叉反应。

快速便捷：全程检测时间2-4小时，适配自动化核酸提取仪和荧光PCR仪，支持高通量检测。

封闭式检测：减少污染风险，操作需在生物安全柜中进行。

注意事项

严格遵守实验室生物安全规范，避免交叉污染。

试剂需-20℃避光保存，避免反复冻融；操作时佩戴手套、实验服等防护装备。

结果判读需结合临床症状和其他检测结果进行综合评估。

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