转基因植物NPTII基因检测试剂盒(荧光PCR法)

转基因植物NPTII基因检测试剂盒(荧光PCR法)

简介：

该试剂盒主要用于检测转基因植物中筛选标记基因NPTII（新霉素磷酸转移酶II基因），采用荧光定量PCR技术实现高灵敏度、特异性的定性或定量分析‌。

核心特点：

‌高特异性‌：通过设计特异性引物和荧光探针，确保仅扩增NPTII目标序列，避免假阳性‌。

‌灵敏度高‌：可检测低至0.1%的转基因成分（如含NPTII的作物）‌。

‌内标设计‌：部分试剂盒整合植物内源基因（如18S-rRNA）作为内标，排除假阴性风险‌。

‌快速高效‌：实时荧光监测缩短检测时间，封闭反应体系减少污染‌。

注意事项：

1. ‌试剂盒组成与原理‌

‌核心组分‌：引物、Taq酶、dNTP、模板DNA和Mg²⁺‌

1。引物设计需遵循特异性原则（长度15-30bp，G+C含量40-60%，避免二级结构）‌。

‌技术原理‌：通过荧光探针法（如TaqMan探针）实时监测扩增信号，探针在扩增时被切割释放荧光，信号强度与目标基因量成正比‌。

2. ‌实验流程‌

‌样本处理‌：提取植物DNA，需避免RNA酶污染‌。

‌PCR反应体系‌：按试剂盒说明配制反应液，包括引物、酶、模板等‌。

‌扩增程序‌：通常包括变性（95℃）、退火（55℃左右）和延伸（72℃）循环，循环次数根据灵敏度需求设定（一般30-40次）‌。

操作步骤：

‌一、样本前处理与核酸提取‌

‌样本制备‌：取液氮冻存的植物组织（如叶片），研磨成粉末后按比例加入Trizol试剂（如100mg组织加3ml）‌。

‌RNA提取‌：

匀浆后冰浴10-15分钟，离心取上清。

加入氯仿（0.2ml/ml Trizol）振荡分层，离心后收集水相。

用异丙醇沉淀RNA，75%乙醇洗涤，干燥后溶于无核酸酶水‌。

‌纯度验证‌：260/280nm吸光度比值1.8-2.0，琼脂糖电泳显示28S/18S rRNA条带‌。

‌二、逆转录反应（若检测RNA）‌

将提取的RNA逆转录为cDNA，使用逆转录酶及随机引物或 Oligo(dT)引物‌。

反应条件：42℃ 30分钟，85℃ 5分钟灭活酶。

‌三、荧光定量PCR反应体系配制‌

‌试剂组成‌：

引物对（NPTII特异性引物，长度20-30bp，GC含量40-60%）‌。

TaqMan探针（标记报告基团与淬灭基团）‌。

dNTPs、Taq酶、Mg²⁺及缓冲液‌。

‌内标设置‌：建议加入植物内源基因（如18S-rRNA）作为内参‌。

‌四、PCR扩增程序‌

‌反应条件‌：

预变性：94℃ 3分钟。

循环扩增：94℃ 30秒（变性）→ 55℃ 30秒（退火）→ 72℃ 60秒（延伸），共30-40循环‌。

‌荧光信号采集‌：每循环退火阶段监测荧光强度，记录Ct值。

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