曼那角病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒 新品

曼那角病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

商品属性

预期用途

本试剂盒利用荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）技术，结合特异性引物和DNA结合染料（如SYBR Green I或EvaGreen等），用于体外定性检测人血清、血浆或蚊虫样本中曼那角病毒（马亚罗病毒，MAYV）的RNA。

检测原理

RNA提取： 从待测样本中提取病毒RNA（本试剂盒通常不包含RNA提取组分，需单独准备）。

逆转录 (RT)： 在反应体系中，逆转录酶以病毒RNA为模板，在特异性下游引物或随机引物/寡聚dT引物的引导下，合成互补的cDNA链。

荧光定量PCR (qPCR)： 以cDNA为模板，在热稳定DNA聚合酶的作用下，利用针对曼那角病毒基因组保守区域（通常是非结构蛋白基因如nsP1或结构蛋白基因如E2/E1）设计的特异性引物进行扩增。

荧光检测： 反应体系中包含能嵌入双链DNA（dsDNA）的荧光染料（如SYBR Green I）。在PCR扩增过程中，随着目标产物的积累，荧光染料与dsDNA结合的量增加，导致荧光信号增强。仪器实时监测每个循环结束时的荧光强度。

结果判定： 通过分析荧光信号达到预设阈值（Ct值）所需的循环数，结合阳性/阴性对照，判断样本中是否存在曼那角病毒RNA。熔解曲线分析（Melting Curve Analysis）可用于验证扩增产物的特异性（单一峰形）和区分非特异性扩增或引物二聚体。

锐器盒。

样本要求

样本类型： 人血清、血浆、蚊虫匀浆上清液等。其他样本类型请参考文献或咨询厂商确认适用性。

采集与运输： 按标准生物样本采集规范操作。血清/血浆样本建议在2-8°C下运输，长期保存应置于-70°C或更低温度。避免反复冻融。

RNA提取： 使用合适的RNA提取试剂盒严格按照说明书操作。提取的RNA应尽快用于RT-qPCR检测，或保存于-70°C/-80°C。避免RNA酶污染。

操作步骤

重要提示： 操作全程应在洁净环境中进行，严格分区（试剂准备区、样本处理/加样区、扩增/检测区），避免污染。使用带滤芯吸头。所有试剂使用前应充分解冻（置于冰上或室温），混匀并短暂离心。

1. 反应体系配制 (在试剂准备区)

计算： 根据待测样本数（n），加上阳性对照（1管）、阴性对照（1-2管）和可能需要的复孔，计算所需反应数（N）。

配制主混合液 (Master Mix)：

每个反应所需体积：

2X RT-qPCR预混液： 10 µL

引物混合液： 2 µL

无核酸酶水： 3 µL

总体系：15 µL / 反应 (不含模板RNA)

在一个无菌无核酸酶的离心管中加入：

(N x 10 µL) 的 2X RT-qPCR预混液

(N x 2 µL) 的 引物混合液

(N x 3 µL) 的 无核酸酶水

轻轻涡旋混匀，短暂离心。

2. 分装与加样 (在样本处理区)

将配制好的主混合液分装至PCR反应管/板孔中，每孔15 µL。

加入模板RNA：

在相应孔中加入5 µL提取的待测样本RNA。

在阳性对照孔中加入5 µL 曼那角病毒阳性对照。

在阴性对照孔中加入5 µL 阴性对照。

盖紧管盖或封好反应板，短暂离心混匀并去除气泡。

3. RT-qPCR扩增与检测 (在扩增/检测区)

将反应管/板放入实时荧光定量PCR仪中。

设置并运行以下循环程序（示例，具体参数需优化，请参考厂商推荐或自行验证）：

逆转录 (RT)： 50°C 10 - 30 分钟 (1个循环)

预变性/热启动激活： 95°C 2 - 5 分钟 (1个循环)

PCR扩增 (40-45个循环)：

变性： 95°C 10 - 15 秒

退火/延伸/荧光采集： 60°C 30 - 60 秒 (在此步骤结束时采集荧光信号 - SYBR Green通道)

熔解曲线分析 (可选但强烈推荐)：

95°C 15 秒

60°C 1 分钟

缓慢升温至95°C (如0.3°C/秒)，并连续采集荧光信号 (用于检测产物特异性)。

结果解释

质量控制：

阴性对照 (NC)： 应无扩增曲线（Ct值 = Undetermined 或 > 40）或熔解曲线显示无特异性峰。

阳性对照 (PC)： 应有典型的S型扩增曲线，Ct值应在预期范围内，熔解曲线显示单尖锐的特异性峰。

如果对照结果不符合要求，本次实验无效，需排查原因后重新实验。

样本结果判定 (定性)：

阳性： 样本孔出现S型扩增曲线，且Ct值 ≤ 预设的Cut-off值（例如：Ct ≤ 38 或 40，需根据试剂盒验证和实验室SOP确定），并且熔解曲线峰形与阳性对照一致（单Tm值与阳性对照接近，通常在±1°C内）。

阴性： 样本孔无扩增曲线（Ct值 = Undetermined 或 > Cut-off值），或者虽有扩增曲线但熔解曲线峰形异常（如多峰、宽峰、Tm值与阳性对照差异显著），表明可能是非特异性扩增或引物二聚体，应判为阴性。

无效： 如果内参（如果使用）或质控失败，或结果无法明确判定，应判为无效，建议重复检测。

熔解曲线分析： 是染料法确认特异性的关键步骤。必须将样本的熔解曲线峰形和熔解温度（Tm值）与阳性对照进行比较，确保一致。

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