NAD+/NADH测定试剂盒(WST-8法) | NAD + /NADH | EnkiLife恩玑生命

产品简介

NAD + /NADH 检测试剂盒(WST-8 法)是一种基于 WST-8 的显色反应，通过比色法来检测细胞、组织或其它样品中 NAD + (氧化型辅酶 I)和 NADH (还原型辅酶 I)各自的量、比值和总量的检测试剂盒。NAD (Nicotinamide adenine dinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)是所有细胞中都存在的一种辅酶，包括 NAD + (氧化型)和 NADH (还原型)两种形式。NAD + 既是氧化还原反应过程中传递电子的辅酶，又可以作为很多酶的底物来参与细胞内反应。例如 Sirtuins 家族的 Sirt1 等去乙酰化酶就需要以 NAD+ 作为底物进行去乙酰化反应来调控蛋白的乙酰化水平从而参与细胞的生命活动过程。NAD + 在细胞和体内发挥着重要的功能，其合成和降解及其产物参与细胞凋亡、代谢调控和基因表达的调控等，并且 NAD + 的减少是细胞死亡的主要因素之一。NAD + 在调节细胞氧化还原状态方面的重要性以及调控信号通路及转录方面的功能，使得 NAD + 及其合成和消耗的酶成为多种疾病的潜在药物靶点。

检测原理

NAD + /NADH 以及的传统检测方法是检测 NADH 在 340nm 处吸收波长的变化，该方法灵敏度较低并易受样品中有类似紫外吸收物质的干扰，并且在紫外检测过程中通常需要加大检测样品量以弥补 NADH 在 340nm 处吸光度过小的不足，因此该传统检测方法具有很大的局限性。本试剂盒可检测样品中 NAD + 、NADH 的含量以及它们的比值，具体原理如下：

a.测定 NAD + 和 NADH 的总量：乙醇(Ethanol)在乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)的作用下氧化生成乙醛(Acetaldehyde)，在这一反应过程中 NAD + 被还原为 NADH；生成的 NADH 在电子耦合试剂 1-mPMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium MethylSulfate)的作用下将 WST-8 还原生成橙黄色的 formazan，在 450nm 左右有最大吸收峰。反应体系中生成的 formazan 与样品中 NAD + 和 NADH 的总量呈比例关系。

b. 单独测定NADH的量：60ºC水浴加热30分钟后，样品中NAD + 会分解而只保留NADH。NADH 将 WST-8 还原成formazan，通过比色法确定反应生成的 formazan 的量，最终可以确定样品中 NADH 的量。

c. 测定 NAD + 以及 NAD + /NADH 比值：根据前两步检测获得的 NAD + 和 NADH 的总量以及 NADH 的量，即可计算得到样品中 NAD + 的量以及 NAD + /NADH 的比值。WST-8 是 MTT 的一种升级替代产品，和 MTT 或其他 MTT 类似产品如 XTT、MTS 等相比有明显的优点。首先，MTT 被一些脱氢酶还原生成的 formazan 不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而 WST-8 和 XTT、MTS 产生的 formazan 都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-8 产生的 formazan 比 XTT 和 MTS 产生的 formazan 更易溶解。再次，WST-8 比 XTT 和 MTS 更加稳定，使实验结果更加稳定。另外，WST-8 和 MTT、

XTT 等相比，线性范围更宽，灵敏度更高。WST-8 和 WST-1 相比，检测灵敏度更高，更易溶解，并且更加稳定。本试剂盒使用便捷，灵敏度高，线性范围宽。可以检测含量低至 0.25μM 的 NAD + 或 NADP，在 0.25μM 至 10μM 之间呈现良好的线性关系。使用细胞、组织等的裂解液即可进行检测，无需分离纯化细胞、组织或其它样品中的 NAD + 和 NADH，并且能特异性检测 NAD + 和 NADH，而不检测 NADP + 和 NADPH。

保存条件

未拆封的试剂盒可在 -20℃保存 12 个月， 显色液和 NADH 须-20ºC 避光保存。NADH 配

制成溶液后，须适当分装后-80ºC 保存。所有试剂避免反复冻融。

注意事项

1. 酶标仪最佳检测波长为 460 nm。

2. NADH 不太稳定，取出 NADH 后请尽快使用。如果发现标准曲线不理想，很有可能是标准品发生了降解。

3. 由于 NAD + /NADH 提取液比较粘稠，以该提取液作为稀释液时，无论对标准品还是样品进行稀释，在稀释过程中务必保证稀释均匀，否则易造成实验数据产生较大波动。

4. 由于 NAD + 和 NADH 很不稳定，在冻存过程中较易降解，所以宜尽量使用新鲜样品进行检测。

5. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。