苯丙氨酸解氨酶（PAL）检测试剂盒（微量法100T/96S）

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalnine ammonialyase，PAL）试剂盒说明书

                                                  微量法 100管/96样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定                                             

测定意义：

PAL（EC4. 3 1 5）广泛存在于各种植物和少数微生物中，是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切相关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用。

测定原理：

PAL催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸和氨，反式肉桂酸在290nm处有最大吸收值，通过测定吸光值升高速率计算PAL活性。

组成：

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入4ml蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存；

自备仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、研钵、冰和蒸馏水。

粗酶液提取：

按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至290nm，蒸馏水调零。

2. 准备96孔UV板一块（非普通酶标板，普通酶标板只能透过可见光，不能透过紫外光，检测波长小于340nm务必使用UV板）。

3、在EP管或96孔UV板中按顺序加入下列试剂

混匀，30℃ 准确反应30min

混匀，静置10min后， 290nm处记录测定管吸光值A1和对照管吸光值A2，△A=A1-A2。

注意：对照管只要做一管

PAL活性计算：

用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1. 按蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白在每ml反应体系中每min使290nm下吸光值变化0.1为一个酶活性单位。

PAL（U/mg prot）=ΔA×V反总÷（Cpr× V样）÷0.1÷T =13.3×ΔA÷Cpr

2. 按样本鲜重计算

单位定义：每g组织在每ml反应体系中每min使290nm下吸光值变化0.1为一个酶活性单位。

PAL（U/g鲜重）＝ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.1÷T =13.3×ΔA÷W

V反总：反应体系总体积，0.2ml； V样：加入样本体积，0.005ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g。

用96孔板测定的计算公式如下

（1） 按蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白在每ml反应体系中每min使290nm下吸光值变化0.05为一个酶活性单位。

PAL（U/mg prot）=ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.05÷T =26.6×ΔA÷Cpr

1. 按样本鲜重计算

单位定义：每g组织在每ml反应体系中每min使290nm下吸光值变化0.05为一个酶活性单位。

PAL（U/g鲜重）＝ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.05÷T =26.6×ΔA÷W

V反总：反应体系总体积，0.2ml； V样：加入样本体积，0.005ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g。