丙酮酸羧化酶（PC）检测试剂盒（分光光度法 50T/48S）

丙酮酸羧化酶（PC)试剂盒说明书

                                                  分光光度法 50管48样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定                                             

测定意义：

丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中，催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，是糖异生过程的第一个限速酶，在保证血糖的动态平衡方面起着重要的作用。

测定原理：

PC催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+，在340nm下测定NADH氧化速率，即可反映PC活性。

组成：

自备仪器和用品：

分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 ml石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1. 称取约0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1ml提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2. 将匀浆600g，4℃离心5min。

3. 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

4. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的PC（此步可选做）。

5. 在步骤④的沉淀中加入1ml提取液，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体PC活性测定。

测定步骤：

1. 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2. 工作液的配制：临用前将试剂二和试剂三转移到试剂一中混合溶解待用；置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热5分钟；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3. 试剂四的配制：在试剂四瓶中加入2.5ml蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

4、在1ml石英比色皿中加入50μl样本、50μl试剂四和900μl工作液，立即混匀，记录340nm处初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

注意：在该试剂盒中，若ΔA大于0.5，需将样本用提取液稀释适当倍数后测定，使ΔA小于0.5可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。

PC活性计算：

（1）按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PC（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=1608×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PC（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=3.215×ΔA

V反总：反应体系总体积，1×10-3 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。