乙酰胆碱酯酶（AchE）检测试剂盒（分光光度法50T/48S）

乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AchE）活性测定试剂盒说明书

                                                  分光光度法 50管/48样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定                                             

测定意义：

AchE属于丝氨酸水解酶，广泛存在于各种动物组织和血清中。AchE催化乙酰胆碱（Ach）水解，在神经传导调节中起重要作用。

测定原理：

AchE催化Ach水解生成胆碱，胆碱与二硫对硝基苯甲酸（DTNB）作用生成5-巯基-硝基苯甲酸（TNB）；TNB在412nm处有吸收峰，通过测定412 nm吸光度增加速率，计算AchE活性。

组成：

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入2.6ml试剂一，充分震荡溶解。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入2.6ml试剂一，充分震荡溶解。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 ml玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液）进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心10min，取上清液待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1ml提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体：直接测定。

测定操作：

1. 分光光度计预热30 min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于37℃水浴中预热30min。

3. 取1ml玻璃比色皿，依次加入100μl上清液、800 μl试剂一、50μl试剂二和50 μl试剂三，迅速混匀，于412nm处测定3min内吸光值变化，第10s吸光值记为A1，第190s吸光值记为A2。△A测定管=A2-A1。

AchE活性计算公式：

1. 组织AchE活性

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷（Cpr ×V样）÷T

= 245×△A÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min/g鲜重)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷（W ×V样÷V样总）÷T

= 245×△A÷W

2. 细菌、细胞AchE活性

活性单位定义：每104个细胞每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min/104 cell)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T

= 245×△A÷细胞数量

3. 血清AchE活性

活性单位定义：每毫升血清每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min /ml)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷V样÷T

=245×△A

ε：TNB摩尔消光系数，13.6×103 L/mol/cm；V反总：反应体系总体积（L），1 ml=0.001 L；106：1mol=1×106μmol；V样总：加入提取液体积，1ml；Cpr：蛋白浓度（mg/ml）；W：样本质量，g；V样：加入上清液体积（ml），0.1 ml；T：反应时间（min），3 min。