犬利什曼原虫染料法荧光定量PCR试剂盒

产品名称：犬利什曼原虫染料法荧光定量PCR试剂盒

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本产品是以染料法荧光定量PCR技术为基础开发的PCR试剂盒，它具有下列特点：

1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。

2.引物等组分经过优化，灵敏度高。

3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4.特异性高，引物是根据高度保守区设计，不会跟其他的DNA/RNA发生交叉反应。

5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。

6.本产品足够50次20μL体系的染料法荧光定量PCR反应。

犬利什曼原虫染料法荧光定量PCR试剂盒操作方法

一、制备标准曲线样品（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1.标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

2.用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

3.在7号管中加入5 μL 阳性对照（其浓度为1×10E8拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4.换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5.换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

1.用自选方法纯化样品的DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。

2.如果有N个样品，则需要进行N+2个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。

三、设置qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

如果进行定量分析，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。如果做定性分析，则6个标准曲线样品只选一个做（可以选4号，其余样品不变）。以下只介绍定量分析的反应设置。

【样品要求】

1. 根据实际情况采样，胃液分泌物、胃液呕吐物以及样品培养物作为检测样本，具体参考《临床微生物样本采集规范》。

2. 应避免样本间交叉污染，样本采集后应及时检测，也可保存于-20±5℃待检，长期保存应置于-70℃以下。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融少于 7 次，有效期 12 个月。

犬利什曼原虫染料法荧光定量PCR试剂盒检测方法的局限性

1样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

犬利什曼原虫染料法荧光定量PCR试剂盒注意事项

1 所有操作严格按照说明书进行；

2 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；

3 反应液应避光保存；

4反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

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