产品名称: 真菌染料法荧光定量PCR试剂盒
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本产品是以染料法荧光定量PCR技术为基础开发的PCR试剂盒,它具有下列特点:
1.即开即用,用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物等组分经过优化,灵敏度高。
3.提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
4.特异性高,引物是根据高度保守区设计,不会跟其他的DNA/RNA发生交叉反应。
5.既可用于定性检测,又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
6.本产品足够50次20μL体系的染料法荧光定量PCR反应。
真菌染料法荧光定量PCR试剂盒操作方法
一、制备标准曲线样品(以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1.标记6个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。
2.用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同)。
3.在7号管中加入5 μL 阳性对照(其浓度为1×10E8拷贝/μL,试剂盒提供),充分震荡1分钟,得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头,在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头,在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
1.用自选方法纯化样品的DNA,本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。
2.如果有N个样品,则需要进行N+2个样品提取,多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。
三、设置qPCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)
如果进行定量分析,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照,6个用于标准曲线样品。如果做定性分析,则6个标准曲线样品只选一个做(可以选4号,其余样品不变)。以下只介绍定量分析的反应设置。
【样品要求】
1. 根据实际情况采样,胃液分泌物、胃液呕吐物以及样品培养物作为检测样本,具体参考《临床微生物样本采集规范》。
2. 应避免样本间交叉污染,样本采集后应及时检测,也可保存于-20±5℃待检,长期保存应置于-70℃以下。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融少于 7 次,有效期 12 个月。
真菌染料法荧光定量PCR试剂盒检测方法的局限性
1样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;
2 样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;
3 阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;
4 病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;
5 不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;
6 试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;
7本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
真菌染料法荧光定量PCR试剂盒注意事项
1 所有操作严格按照说明书进行;
2 试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完全混匀并短暂离心;
3 反应液应避光保存;
4反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;
5 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;
6样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
7实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;
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