品名：Smart-meRIP™ meRIP Kit，货号：meRIP-1001，品牌：Engibody
订购及技术咨询：朱小鸥，13817407320(微信同号)
NIH、麻省理工、哈佛、斯坦福等世界名校课题组青睐并长期采购的meRIP试剂盒！
磁珠法methylated RNA免疫沉淀试剂盒
Smart-meRIP™ 保姆级meRIP试剂盒的优势
1、本kit适用于来自细胞、动物组织、植物组织、血液及包埋组织的total RNA、mRNA、lncRNA及circRNA等的甲基化分析。
2、搭配不同抗体，可以检测不同甲基化类型，例如m6A、m5C、m7G。
3、本kit适用于细胞浆RNA甲基化及细胞核RNA甲基化。
4、本kit采用优化的洗脱体系，信噪比优于采用游离m6A洗脱的MeRIP流程。
5、本kit包含阴性对照lgG抗体，方便IP实验质控。
6、本试剂盒适配下游RT-qPCR以及特定甲基化的全转录组测序。
第一部分：背景简介
RNA转录后修饰
RNA修饰开始被认为仅仅是RNA在核酸结构上的化学微调，随着前沿研究技术的发展以及相关抗体的出现，当前发现RNA修饰在转录组水平广泛存在，并且是可逆的动态调控状态，参与生物进程的多方面，包括：细胞分化、性别决定、肿瘤的发生和转移、DNA的损伤修复等生物学功能。
由于甲基化修饰约占所有RNA修饰的60%以上，而N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A），作为最常见的一种转录后修饰，在RNA甲基化中占比超过80%。
常见5种RNA甲基化修饰类型(m6A, m6Am, m5C, m1A, m7G)
m6A
m6A（N6-methyladenosine，6-甲基腺嘌呤）是真核生物mRNA内部序列中最常见的一种甲基化修饰，同时可以功能性的调节真核生物的转录组从而影响mRNA的剪接、出核、定位、翻译和稳定。m6A RNA出现在多种重要的细胞生命过程中，意味着mRNA甲基化参与了多种生物学过程，如干细胞分化、生物节律等，同时也参与了多种疾病的发生，包括肿瘤、肥胖和不育等。
目前对m6A的转录组研究方法为MeRIP-seq（mRNA甲基化测序）的方法，其原理是通过m6A特异性抗体对细胞内具有m6A修饰的RNA片段进行免疫共沉淀，将富集下来的RNA片段进行高通量测序。结合生物信息学分析，即可在全转录组范围内对m6A修饰进行系统研究。
m6A修饰同时受到多种蛋白的调控，这些蛋白可以分为3类，分别是添加甲基化修饰的书写蛋白（writer protein）, 去除甲基化修饰的擦除蛋白（Eraser protein）, 以及识别、结合甲基化修饰的阅读蛋白（reader protein）。Writer protein是甲基转移酶，如WTAP、METTL3、METTL14等；Eraser protein是去甲基化酶，如FTO、ALKBH5等；Reader protein包括一些转录调控因子，如ELAVL1，YTHDF1/2/3等。
m6A 修饰可以调控mRNA剪接、RNA编辑、影响RNA降解速率、RNA翻译速率等等，在胚胎发育、脂肪形成、疾病发生发展等众多生物学过程中发挥调控作用。
m5C
5-甲基胞嘧啶（5-Methylcytosine，m5C），在RNA中广泛分布，早在上世纪70年代就已发现存在于mRNA上。当时由于技术的局限性，一直未能充分研究。近期研究发现mRNA m5C在哺乳动物中的分布十分保守，在不同组织中修饰的基因具有特异性。
m7G
N7-甲基鸟苷（N7-methylguanosine，m7G）是真核生物tRNA、rRNA和mRNA 5'cap中最丰富的修饰之一。作为一种重要的表观遗传修饰，m7G RNA甲基化在基因表达、加工代谢、蛋白质合成、转录稳定等方面发挥着重要的作用，参与疾病发生发展等多种生命过程。
第二部分：技术原理和技术流程
技术原理：
meRIP（methylation-modified RNA Immunoprecipitation Assay），甲基化RNA免疫沉淀实验的基本原理是从样本中抽提RNA，对RNA进行片段化。然后每个样品一分为三，一部分片段用针对该修饰的特异性抗体与RNA片段进行免疫沉淀(IP)，留为IP样品，另一部分用阴性对照抗体normal IgG来免疫沉淀，最后一部分不进行IP直接留作Input样品。下游可以进行RT-PCR分析和RNA-Sequence测序。
技术流程：
根据研究目的的不同，采用2种略有不同的技术流程
MeRIP-PCR既可对完整的m6A转录本（Intact）进行检测，也可对该转录本的m6A修饰区域（m6A-deposited Fragments）进行检测。
先打断RNA再IP
下游荧光定量PCR中是片段化的RNA对应的cDNA片段（200nt左右），需要设计甲基化位点特异性的引物进行qPCR
下游sequence测序时的插入片段也是短的cDNA片段（100nt左右）
优势：
可以大致确定甲基化位点所在的区域，精确到100-200nt的范围。
劣势：
1、在荧光定量PCR时需要准确预测可能的修饰区域，才能把引物设计好，如果预测的区域有误，那么设计的引物将无法进行PCR，会导致假阴性结果。
2、在sequence测序时无法得到整条RNA的序列信息，得到的只能是甲基化位点周围的100nt的序列信息，对于发现未知RNA不利。
先不打断RNA，通过IP把整条RNA完整免疫沉淀下来
荧光定量PCR中是完整的cDNA，不需要设计甲基化位点特异性的引物进行qPCR，只需要引物落在整条cDNA上就可以了。
Sequence测序时的插入片段是短的cDNA片段（100nt左右，建库时打断的）
优势：
1、荧光定量PCR时设计引物比较简单，只要是这条RNA上的引物都可以，无需为了设计位点特异性的引物去预测可能的甲基化位点。
2、测序时可以得到整条RNA的碱基序列信息，对于未知RNA的发现是特别有用的。
劣势：
不能确定甲基化位点所在的区域，只能定性定量这条RNA上有甲基化，至于在哪个具体位点，无法得知。
本试剂盒采用先片段化RNA，随后IP的技术流程:
本试剂盒采用的meRIP实验流程
meRIP实验中IP得到的片段在测序后与外显子的比对组装
第四部分：meRIP实验结果与示例展示
结果示例，如下列图片所示：
m 6 A induced the upregulation of LINC00958 in BC cells. A MeRIP-Seq analysis
revealed a notable m 6 A modification site at the LINC00958 location. B RT-PCR indicated upregulated METTL3 mRNA expression in the BC cell line (MCF-7). C METTL3 knockdown (sh-METTL3) was transfected into MCF-7 cells to silence METTL3 expression. D M 6 A analysis (colorimetric method) presented m 6 A modification enrichment in sh-METTL3 or sh-NC transfection. E MeRIP-qPCR illustrated the m 6 A-modified LINC00958 level after METTL3 silencing or control. F RNA stability analysis demonstrated the LINC00958 level in MCF-7 cells transfected with METTL3 silencing. **p < 0.01 was considered as significant.
第五部分：磁珠法meRIP试剂盒组分清单
（共计23个组分，均可单独购买）
| 编号 | 组分名称 | 数量 | 保存 | 注意 |
| 下列组分收到后需储存在 4 °C中，磁珠千万不要冷冻。 |
| meRIP-001 | meRIP级Protein A/G 磁珠
(核酸预包被，非特异性RNA结合极其低) | 1 mL | +4 °C | 不能冷冻
不能高速离心 |
| meRIP-002 | 磁珠洗涤液 | 50 mL | +4 °C |
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| meRIP-003 | 磁珠-抗体结合反应液 | 5 mL | +4 °C |
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| meRIP-004 | 10× RNA Fragmentation Buffer | 0.5 mL | +4 °C |
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| meRIP-005 | Stop Buffer | 0.5 mL | +4 °C |
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| meRIP-007 | meRIP Wash Buffer 1 | 15 mL | +4 °C |
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| meRIP-008 | meRIP Wash Buffer 2 | 15 mL | +4 °C |
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| meRIP-009 | meRIP Elution Buffer | 4 mL | +4 °C | 如有絮状物，使用前需要置室温恢复溶解 |
| 下列组分收到后必须要储存在 -20 °C中 |
| meRIP-017 | m6A MeRIP Primers Human EEF1A1 Positive阳性对照引物对
F: CGG TCT CAG AAC TGT TTG TTT C
R: AAA CCA AAG TGG TCC ACA AA |
| -20 °C |
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| meRIP-018 | m6A MeRIP Primers Human EEF1A1 Negative阴性对照引物对
F: GGA TGG AAA GTC ACC CGT AAG
R: TTG TCA GTT GGA CGA GTT GG |
| -20 °C |
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| meRIP-019 | RNase抑制剂 | 100 µL | -20 °C |
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| meRIP-020 | 蛋白酶K | 100 µL | -20 °C |
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| meRIP-021 | RIP级Normal Mouse IgG阴性对照 | 100 µL | -20 °C |
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| meRIP-022 | RIP级Normal Rabbit IgG阴性对照 | 100 µL | -20 °C |
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| meRIP-023 | RNA级助沉剂 | 100 µL | -20 °C |
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| meRIP-006 | RNA沉淀缓冲液 | 1.5 mL | -20 °C |
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订购及技术咨询：朱小鸥，13817407320(微信同号)
