人间充质干细胞培养基

                        Xeno-free人间充质干细胞培养基

一、产品基本信息

二、产品简介

Xeno-Free人间充质干细胞培养基是埃泽思生物（Applied Cell^®）自主研发的一款无外源动物成分的人间充质干细胞培养基。可应用于人骨髓、脂肪、脐带等组织来源的间充质干细胞的原代分离、扩增与传代培养，并保持其多向分化潜能。本产品内毒素水平远低于中国药典标准，生产过程遵循ISO9001体系,并符合GMP指导原则。

Xeno-Free人间充质干细胞培养基主要成分：氨基酸，维生素、无机盐、白蛋白，转铁蛋白、胰岛素、微量元素，细胞因子等。

三、产品特性

l 无外源动物蛋白成分，大大降低各类病毒、霉菌和支原体等的污染风险。

l 全程无血清生产，极大降低批次间差异。

l 可用于原代分离，且培养过程无需包被培养板。

l 扩增效率高，24h左右增殖翻倍，节省培养时间。

l 内毒素<0.06EU/ml，远低于中国药典水平

四、产品内容

五、相关产品

无血清细胞冻存液（治疗级）（Applied Cell^®: Cat. no.AC-1001006）

人脐带间充质干细胞（Applied Cell^®: Cat. no.AC-2001003）

人脂肪间充质干细胞（Applied Cell^®: Cat. no.AC-2001004）                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                   

细胞消化液（Applied Cell^®: Cat. no. AC-1001024） 

六、实验准备

1.  人间充质干细胞培养基配制

1.1. 37℃快速解冻人间充质干细胞添加剂，快速溶解时不易破坏添加剂中营养物质，时间大致为10min。待添加剂融化后摇匀，分装或直接按比例添加到基础培养基中，分装后添加剂立即储存于-20℃至-80℃，避免反复冻融 。

1.2. 将添加剂以10%比例加入到人间充质干细胞基础培养基中，混匀，即为人间充质干细胞培养基（AC-1001003）。混合后培养基可在2-8℃ 稳定储存2-3周，不建议使用已配制超过3周的培养基。

1.3. 人间充质干细胞培养基可直接应用于人类骨髓、脂肪、脐带等组织来源的间充质干细胞的原代分离、扩增与传代培养。

七、操作方法(以下步骤皆应在无菌条件下操作)

1. hMSC细胞复苏(10cm dish)

1.1. 从液氮中取出冻存的hMSC细胞，迅速将冻存管放入37℃水浴快速融解。

1.2. 在生物安全柜或超净台中，将解冻后的细胞悬液缓慢加入5 mL预温的人间充质干细胞培养基（AC-1001003）。

1.3. 1200rpm 离心3 min，吸掉上清，加入10ml人间充质干细胞培养基重悬细胞。

1.4. 将细胞均匀铺到培养皿中，水平十字振动培养皿使细胞均匀分布，5% CO₂的37℃恒温细胞培养箱中培养24小时后观察细胞状态。

1.5. 24h后更换新鲜人间充质干细胞培养基继续培养，每2-3天更换培养液。

2. hMSC细胞传代培养

2.1. 在显微镜下观察细胞，当细胞融合度达到90%，即可传代。

2.2. 在超净台/安全柜中，吸掉原有培养基，加入PBS溶液清洗一次，加入细胞消化液（AC-1001024）使之完全覆盖皿/瓶底。

2.3. 室温孵育4-5分钟或37℃孵育2-4分钟，显微镜下观察大部分细胞脱离皿底即停止消化。

2.4. 加入消化液2倍体积的人间充质干细胞培养基，用移液器轻轻吹打瓶壁上未完全脱离的细胞，并轻轻吹打混匀，使细胞完全分散。

2.5. 将细胞悬液转移到15 mL离心管中，1200 rpm离心3 min。

2.6. 弃上清，加入人间充质干细胞培养基，重悬细胞，计数。1：3-1：4比例传代，或按1-2x10⁴ cells/cm²  传代，均匀铺在培养皿/瓶中，置于37℃，5%CO₂ 培养箱中培养。

注意：细胞传代所需的时间：2-4天。5代及之前的细胞，生长速度较快。5代以后的细胞，生长速度稍缓。

3. hMSC细胞冻存

3.1. 细胞达到90%汇合度， 吸掉原有培养基，PBS清洗一次。

3.2. 加入细胞消化液（AC-1001024）使之完全覆盖皿/瓶底，室温孵育4-5min或37℃孵育2-4min分钟，显微镜下观察大部分细胞脱离皿底即停止消化。

3.3. 加入消化液2倍体积的人间充质干细胞培养基，用移液枪轻轻吹打瓶壁上未完全脱离的细胞，并轻轻吹打混匀，使细胞完全分散。

3.4. 将细胞悬液转移到15 mL离心管中，1200 rpm离心3 min，吸掉上清。

3.5. 加入适量无血清细胞冻存液（治疗级）（AC-1001006），调整细胞冻存密度在1×10⁶ cells/mL

3.6. 左右，每支冻存管分装1.5-2ml。

3.7. 直接放入-80℃，24h后转入液氮中长期保存。

八、细胞形态图

九、质量控制