Annexin V-AF647/ 7-AAD荧光双染细胞凋亡检测试剂盒（20T）

 保存条件

7-AAD染色液适当分装后-5~-20℃可保存1年，其他试剂2~8℃可保存1年。Annexin V-Elab Fluor^® 647禁止冷冻保存。

实验原理

Annexin V-Elab Fluor^® 647/7-AAD 荧光双染细胞凋亡检测试剂盒，可用于检测悬浮细胞和贴壁细胞的凋亡。

Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸 (PS) 有高度亲和力。当细胞发生凋亡时，膜内侧的磷脂酰丝氨酸 (PS) 外翻到膜表面，而被荧光染料Elab Fluor^® 647/7-AAD标记的Annexin V结合，可通过流式细胞仪或荧光显微镜进行检测。

由于凋亡晚期或坏死细胞膜丧失完整性，而7-氨基放线菌素D（7-Amino Actinomycin D, 7-AAD）可与双链DNA特异性结合并产生强烈的荧光，与Annexin V搭配使用，可区分处于不同凋亡时期的细胞。

本试剂盒检测喜树碱诱导的Jurkat细胞凋亡效果如下图所示：

试剂配制

1×Annexin V Binding Buffer：取1 mL Annexin V Binding Buffer (10×)加入9 mL去离子水中混匀。

实验操作

一步法

1．  细胞按照实验方案进行凋亡诱导，300 ×g离心5 min，弃上清，收集细胞，PBS洗涤一次，轻轻重悬细胞并计数。

2．  取1~5 × 10⁵重悬的细胞，300 ×g离心5 min，弃上清。用PBS洗涤细胞一次，离心后弃上清，加入500 μL稀释的1 × Annexin V Binding Buffer重悬细胞。

3．  细胞悬液中加入5 μL的Annexin V-Elab Fluor® 647染色液和5 μL的7-AAD 染色液 (100μg/mL)。

4．  轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15~20 min。

5．  立即上机检测。如不能及时检测，请于冰上避光静置并于1小时内完成检测。

注：流式细胞仪检测时Annexin V-Elab Fluor® 647可用APC通道，7-AAD选择PerCP/Cy5.5通道。

两步法

1．  细胞按照实验方案进行凋亡诱导，300 ×g离心5 min，弃上清，收集细胞，PBS洗涤一次，轻轻重悬细胞并计数。

2．  取1~5 × 10⁵重悬的细胞，300 ×g离心5 min，弃上清。用PBS洗涤细胞一次，离心后弃上清，加入100 μL稀释的1 × Annexin V Binding Buffer重悬细胞。

3．  细胞悬液中加入2.5 μL的Annexin V-Elab Fluor^® 647染色液和2.5 μL的7-AAD 染色液 (100μg/mL)。（由于两步法分辨率更高，染色液用量减半依然可得到媲美一步法的效果；用户亦可根据自己的模型进行滴定后加入适量的染色液，用更少的量获得高质量的结果。）

4．  轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15~20 min。

5．  加入400 μL稀释的1 × Annexin V Binding Buffer，混匀样本。

6．  立即上机检测。如不能及时检测，请于冰上避光静置并于1小时内完成检测。

注：流式细胞仪检测时Annexin V-Elab Fluor® 647可用APC通道，7-AAD选择PerCP/Cy5.5通道。

注意事项

1.         本产品仅供科研使用。

2.         检测贴壁细胞时，需收集诱导凋亡后产生的悬浮细胞，并与后续收集的贴壁细胞一起检测。

3.         应尽量避免消化贴壁细胞带来的机械损伤。同时，胰酶的消化液中应尽量不含EDTA，因为EDTA会影响Annexin V与磷脂酰丝氨酸的结合。

4.         如果使用含EDTA的胰酶，收集细胞后应充分清洗，确保EDTA被去除干净。

5.         染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。

6.         荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。

7.         为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

(本试剂产品仅供科学研究或进一步生产使用，不可用于临床诊断或治疗)