鬼笔环肽标记系列产品

鬼笔环肽标记系列产品

保存：-20℃干燥、避光保存，有效期一年。

若配制成水溶液，请小量分装保存，避免反复冻融。

注意：产品系列为冻干粉形式或储存液形式；

冻干粉使用前请瞬时离心，加适当溶剂溶解后使用；

储存液形式产品，建议收到产品后，根据单次使用量，对母液进行小量分装，-20℃避光冻存，一年稳定。开始实验前，使用1×PBS 缓冲液稀释储存液到需要的工作浓度。推荐工作浓度为：80~200nM。现配现用。

产品简介：

鬼笔环肽是从致命的伞形毒蕈蘑菇中分离出来的一种毒素。它是特异性结合于F-肌动蛋白的双环肽。因此用荧光染料标记的鬼笔环肽可以非常方便的研究F-肌动蛋白的分布。鬼笔环肽内部，在半胱氨酸和色氨酸之间含有不常见的硫醚桥形成内环结构。在pH升高时，该硫醚被裂解，鬼笔环肽失去对肌动蛋白的亲和力。不同于抗体，鬼笔环肽与肌动蛋白的结合亲和力在不同物种间没有显着变化。非特异性染色可以忽略不计，染色和未染色区域之间的对比度非常大。鬼笔环肽将单体/聚合物的平衡转向聚合状态，将聚合临界浓度降低至30倍。

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荧光标记的鬼笔环肽可在纳摩尔水平染色F-肌动蛋白（1-3）。在各种植物细胞或动物细胞中，标记的鬼笔环肽对大、小细丝具有相似的亲和力，平均每个肌动蛋白亚基结合一个鬼笔环肽分子。

TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明）标记的鬼笔环肽，染色反应特异性强，对比性高，具有比Actin 抗体更好的染色效果，适合用作F-actin 的定性和定量检测。另外，经本品结合后的F-actin 仍能维持actin 自身具有的许多生物学特性。且本品的结合没有物种差异性，适用性广泛。

FITC标记的鬼笔环肽，染色反应特异性强，对比性高，具有比Actin抗体更好的染色效果，适合用作F-actin的定性和定量检测。另外，经本品结合后的F-actin仍能维持actin自身具有的许多生物学特性。且本品的结合没有物种差异性，适用性广泛。

实验图例: 

图1  TRITC标记 图2  FITC标记

图3  488标记

荧光标记操作步骤(仅供参考)： 

1. 储液制备：

荧光染料标记的鬼笔环肽：取适量甲醇或无菌水溶解棕色管中冻干的粉末，制备成200U/mL的储液（300T规格染料加入1.5mL的液体）。

荧光标记的标记鬼笔环肽的一个单位（T）的定义是染色一个加载细胞的载玻片所用染料的量。使用时的推荐稀释比例为1:40-1:200，一个单位相当于200μL总染色体积中加入1-5μL 200U /mL储备溶液。

注：稀释比例可以根据实际染色效果进行适当调整。

2. 细胞染色：

A. 固定细胞染色

以下方案是针对生长在玻璃盖玻片或8孔室玻片上的贴壁细胞的染色步骤。鬼笔环肽也可用于染色固定的冷冻或石蜡组织切片。

1. 用PBS清洗细胞3次。

2. 用含有3.75％甲醛的PBS溶液固定细胞，冰上固定15 min。

3. 注意：甲醇可以在固定过程中破坏肌动蛋白。因此避免含有任何甲醇的固定剂。优选的固定剂是不含甲醇的甲醛。

4. 用PBS清洗细胞3次。

5. 用含0.5％Triton X-100的PBS溶液在室温下透化细胞10 min。

6. 用PBS清洗细胞3次。

7. 用200μL PBS稀释1-5μL荧光标记的鬼笔环肽储液，加入一个盖玻片或孔中，室温孵育20 min，进行染色。

8. 注：染色体积可根据样本情况进行调节。孵育过程中为避免染液挥发，可将盖玻片放于密封容器内。

9. 用PBS清洗细胞2-3次。

10. 荧光显微镜观察。此产品具有很好的光稳定，样品可以在PBS中成像，但为了效果，也可以使用抗荧光淬灭剂观察。

B. 活细胞染色

荧光标记的鬼笔环肽不具有细胞透性，因此没有被广范用于活细胞标记。然而，有报道称活细胞可能通过胞饮或未知机制进行标记。一般来说，染色活细胞时需要更多的染料。或者荧光标记的鬼笔环肽也可被注入到细胞中用于监测肌动蛋白分布和细胞运动。 请查阅参考文献。

罗丹明/FITC标记储存液形式操作参考：

需要自备材料：

1. （可选）甲醇

2. 1×PBS 缓冲液, pH 7.4,细胞培养级别

3. 固定液4%多聚甲醛（溶于PBS 缓冲液）

4. 丙酮或透化液0.5% Triton X-100（溶于PBS 缓冲液）

5. Fluoromount-GTM 水溶性封片剂（不含DAPI），DAPI

6. （可选）DAPI Fluoromount-GTM 水溶性封片剂（含DAPI）

7. （可选）BSA，标准级别

8. 载玻片和盖玻片

9. 盖玻片周围密封液（如透明指甲油）

10. 组装有TRITC 激发/发射滤片，以及DAPI 激发/发射滤片的荧光显微镜或共聚焦显微镜。

操作步骤：

1. 工作液准备

本品以溶于甲醇的20μM 储存液形式提供，总量为300μl。按照100nM 的工作液浓度来换算，可制备总量为60 ml 的工作液。建议收到产品后，根据单次使用量，对母液进行小量分装，-20℃避光冻存，一年稳定。开始实验前，使用1×PBS 缓冲液稀释储存液到需要的工作浓度。推荐工作浓度为：80~200nM。现配现用。

2. 染色步骤

1） 细胞爬片生长24h，使其密度达到50%汇合度。

2） 吸掉培养液，37℃预热的1×PBS（pH 7.4）清洗细胞2 次。

3） 使用溶于PBS 的4%甲醛溶液进行细胞固定，室温固定10min。

注意：避免固定剂中含有甲醇成分，因为甲醇在固定过程中可能破坏肌动蛋白。

4） 室温条件下，用PBS 清洗细胞2~3 次，每次10min。

5） 室温条件下，用丙酮（≤ -20℃）脱水或者用0.5% Triton X-100 溶液透化处理5min。

6） 室温条件下，用PBS 清洗细胞2~3 次，每次10min。

7） 取200μl 配制好的TRITC 标记鬼笔环肽工作液，覆盖住盖玻片上的细胞，室温避光孵育30min（通常情况下，4℃~37℃孵育皆可）。

注意：为了降低背景，可于TRITC 标记的鬼笔环肽工作液内加入1% BSA；另外，孵育过程中为了避免溶液挥发，可将盖玻片转移到一个密封的容器内。

8） 用PBS 清洗盖玻片3 次，每次5min。

9） 使用200μl DAPI 溶液（浓度：100nM）对细胞核进行复染，约30s。

10) 用PBS 清洗盖玻片，然后倒置在已经滴有一滴Fluoromount-GTM 水溶性封片剂的载玻片上。使用纸巾轻轻檫掉多余封片剂，然后用指甲油永久封片。此法制备的标本玻片可置于4℃避光保存，通常6 个月内可继续做F-actin 染色分析。

注意：也可以直接使用含有DAPI 的抗荧光淬灭封片剂合并步骤9）10），简化步骤。

11) 荧光显微镜或者共聚焦显微镜下进行荧光观察，自行选择合适TRITC 激发/发射滤片和DAPI 激发/发射滤片（Ex/Em=364/454nm）。

注意事项：产品非质量问题（产品批次间会存在细微的差异，例如颜色、性状等）可在订货日起一个月内无理由退换；质量问题处理原则以产品本身价值为限，不承担其他连带责任。