泰克生物着力于为客户提供高质量,且具性价比的抗体药物前期发现技术服务。我们在药物抗体发现方面拥有10年的项目开发经验和心得,积累了充足的抗体定制和重组蛋白生产经验。基于酵母体展示技术(Yeast Display Technology)平台的服务,泰克生物能够为客户提供一系列包括但不限于兔源、鼠源、羊源、驼源等不同物种的单克隆抗体制备服务,及其配套的完整可追溯性文件体系。
酵母抗体展示技术(Yeast Display Technology)是指用抗体序列可变区与凝集素Aga2p融合表达,Aga2p蛋白亚基通过两个二硫键与固定在酵母细胞壁上的Aga1p 蛋白亚基结合,结合流式分选技术,将靶向抗原的特异性抗体给筛选出来。
█ 酵母展示抗体文库构建服务
泰克生物可为客户提供来自驼源VHH纳米抗体库,以及其他物种scFv形式抗体的酵母展示文库构建及筛选服务。VHH纳米抗体库,又称为驼源重链抗体文库,抗体分子量大小为15kDa,是驼源动物产生的特有的一种抗体。酵母抗体文库展示体系受限于自身物理特性限制,物理库容滴度一般<107,因此主要应用于客户对项目库容要求不高,动物免疫后PBMC细胞经过二次分选以及避免漏掉二硫键形成的抗体发现项目。同时酵母展示文库相对噬菌体展示文库技术而言,前者在微量抗体表达后抗体活性层面相较于后者要高,得益此基础,在流式筛选时就能区分抗体的亲和力高低。
目前被广泛应用于CarT/Car-NK治疗性抗体,主要以驼源VHH抗体(又被称为纳米抗体)发现为主,VHH/scFv抗体酵母展示发现路径如图1所示:
![1669791016163394.png 企业微信截图_16697909976943.png](/SupplyImg/2022-12-14/6380662240603903197660823.png)
█ 服务内容和周期
步骤 | 服务内容 | QC标准 | 周期 |
Step1:蛋白表达 | (1) 密码子优化+基因模板合成+表达载体构建; (2) 质粒抽提+转染(哺乳表达系统)目的蛋白检测(WB,SDS-PAGE); (3) 蛋白表达放大+蛋白亲和纯化; | 交付:表达载体,克隆甘油菌,重组蛋白3-3.5mg,纯度>85%,标准实验报告 | 4-6周 |
Step2:动物免疫 | (1) 动物免疫4次,加强免疫一针,共计免疫5针; (2) 免疫前采集阴性血清,第4针采血进行ELISA检测血清效价; (3) 若第4针血清抗体效价(蛋白抗原>105;多肽抗原>104)满足要求,则采血前7天再次加强免疫1针,如不满足要求,则继续常规免疫; (4) 效价合格,采血分离单核细胞; | 动物:背景清晰(年龄,性别,防疫情况); 免疫:蛋白抗原>105;多肽抗原>104; 采血:数量100ml以上; PBMC细胞:> 105/vial | 8-10周 |
Step3:模板cDNA制备 | (1) PBMC总RNA提取(RNA提取试剂盒) (2) 高保真RT-PCR制备cDNA(反转录试剂盒) | cDNA:反转后>1ug/ul,胶图分布均匀; cDNA模板总量>150ug; | 1 天 |
Step4:噬菌体展示文库构建 | (1) 以cDNA为模板,两轮PCR扩增VHH基因 酵母表达质粒构建与转化: VHH基因拼接酵母展示载体,电击转化酵母宿主菌,构建抗体库,电击次数不低于10次 鉴定:随机挑选24个克隆,PCR鉴定阳性率+PCR鉴定多样性+插入率 | 文库阳性率:>90%; 文库插入性率:>90%; 库容:>106 | 1-2周 |
Step5:文库筛选(磁珠+Facs) | (1) 磁珠分选; (2) FACS分选(免疫双标分选); (3) 铺板+阳性克隆菌培养+抗体基因测序;(>20个,多达96个); | 阳性标准:双阳性菌株; VHH筛选标准:CDR氨基酸序列不同 | 2-3周 |
Step6:抗体验证(体外验证) | (1) 将获得的抗体序列构建合适的表达载体进行表达+亲和纯化+抗体蛋白定量; (2) Elisa验证抗体与抗原结合,进行下游验证(交付EC50数据); (3) BLI法验证抗体亲和力; (4) 细胞功能验证:流式验证; (5) 验证细胞系(抗原受体过表达细胞系); | 交付:表达载体,克隆菌株,表达菌株,重组抗体蛋白1mg,纯度90%; 快速亲和力测定结果; | 4-6周 |
█ 服务优势
✔物种适应性广泛:人,鼠,兔,羊,羊驼,骆驼,鱼等物种的单抗开发均兼容;
✔技术平台成熟:提供的1级免疫文库的建库库容为106-107;插入率均满足>95%,筛选获得的抗体亲和力普遍处于nM- pM级别;
✔开发周期短:获得PBMC后,建库到筛选获得抗体序列,3-4周;
✔产品交付标准高:针对免疫库,交付免疫前后血清,抗体展示文库,酵母表达菌株,抗体序列;
✔实验记录可追溯:QC质控标准(含RNA提取,cDNA制备等),中英文实验报告,手写实验记录本 。