PCR试剂盒cccDNA染料检测试剂盒组份：
表 1：试剂盒组份
试剂 | 装量 | 贮存条件 |
CHO control DNA | 40ul×1 管 | -20oC |
DNA dilution buffer | 6ml ×1 瓶 | -20oC |
2×Taqman master mix (+UNG/ROX) | 0.75ml ×2 管 | -20oC |
10×CHO qPCR mix | 0.3ml ×1 管 | -20oC |
RNase-Free H2O | 1.5ml×1 管 | -20oC |
规格 ：100 反应
适用机型：
PRISM 7500 Real-Time PCR System (ABI)
StepOne Plus Real-Time PCR System (ABI)
LightCycler 480 (Roche)
AriaMX (Agilent Technologies)
CFX (BIO-RAD)
实验所需但试剂盒未包含材料：
Ø 1.5ml 无菌低吸附离心管
Ø 96 孔 qPCR 板
Ø 一次性手套
Ø 1000ul 、100ul 、10ul 无菌低吸附带滤芯移液枪头
相关设备：
Ø 离心机
Ø 涡旋振荡器
Ø 荧光定量 PCR 仪
Ø 1000ul 、100ul 、10ul 移液器
实验操作过程：
一、 CHO DNA 定量参考品的稀释及标准曲线的制备
用试剂盒中提供的 DNA dilution buffer 将 CHO control DNA 进行梯度稀释， 稀释浓度依 次为 300pg/ul 、30pg/ul 、3pg/ul 、300fg/ul 、30fg/ul 、3fg/ul 。具体操作如下：
1.将试剂盒中的 CHO control DNA 和 DNA dilution buffer 置于冰上融化，待完全融化后，
轻微振荡混匀，简短快速离心。
2.取 6 支干净的 1.5ml 离心管，分别标记为 SD1 ，SD2 ，SD3 ，SD4 ，SD5, SD6。
3，SD1 管中加入 198ul DNA dilution buffer，其余管中分别加入 180ul DNA dilution buffer。
4,取 2ul CHO control DNA 加入 SD1 管中， 然后涡旋振荡混匀 5- 10s 后短时快速离心 5s，涡旋振荡和快速离心各重复 3 次。
5,按表 2 依次进行 6 次梯度稀释操作，稀释操作同步骤 4。
表 2. CHO control DNA 的稀释
稀释管 | 稀释体积 | 浓度 |
SD1 | 2ul CHO control DNA+198ul DNA dilution buffer | 300 pg/ul |
SD2 | 20ul SD1+180ul DNA dilution buffer | 30 pg/ul |
SD3 | 20ul SD2+180ul DNA dilution buffer | 3 pg/ul |
SD4 | 20ul SD3+180ul DNA dilution buffer | 300 fg/ul |
SD5 | 20ul SD4+180ul DNA dilution buffer | 30 fg/ul |
SD6 | 20ul SD5+180ul DNA dilution buffer | 3 fg/ul |
二、加样回收质控 ERC 的制备
根据待测样本的残留量设置 ERC 中 CHO control DNA 的加样浓度 (以制备加 45pg CHO control DNA 的样本 ERC 为例)，操作如下：
1，取待测样本 100u，加至 1.5ml 干净的离心管中；
2，加入 1.5ul SD2，混匀，标记为样本 ERC。
注：样本 ERC 和同批待测样本需一起进行样本前处理。
三、阴性质控 NEG 的制备
根据实验设置阴性质控，操作如下：
1，取 100ul 样本基质溶液(或洗脱液)加至 1.5ml 干净的离心管中标记为阴性质控 NEG。 注：阴性质控 NEG 样本和同批待测样本需一起进行样本前处理。
四、 qPCR 反应液的制备和加样
1，根据所要检测的标准曲线及待测样本数量，计算所需反应孔数，一般做 3 个重复孔/样。
反应孔数= (6 个浓度梯度+1 个无模板对照 NTC+1 个阴性质控 NEG+待测样本×2) ×3 注：待测样本×2 是为了让每个待测样本检测时都同时做样本 ERC 。 2，根据反应孔数计算本次实验所需的各组分的所需总量以制备 pre-mix：
2×Taqman master mix=(反应孔数+2) ×15ul (含有 2 孔的损失量)
10×CHO qPCR mix= (反应孔数+2) ×3ul
RNase-free H2O= (反应孔数+2) ×2ul
3，各试剂置于冰上融化，振荡混匀，按表 3 所示进行加样：
表 3.各反应孔加样示例
标准曲线 | 20ul pre-mix+ 10ul SD1/SD2/SD3/SD4/SD5/SD6 |
NTC | 20ul pre-mix+ 10ul DNA dilution buffer |
NEG | 20ul pre-mix+ 10ul NEG |
待测样本 | 20ul pre-mix+ 10ul 待测样本 |
ERC 样本 | 20ul pre-mix+ 10ul ERC 样本 |
注：加样完成后每孔总体积为 30ul。
表 4. 96 孔板排版示例
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
A | SD6 | SD6 | SD6 |
| S1 | S1 | S1 |
| S1 ERC | S1 ERC | S1 ERC |
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B | SD5 | SD5 | SD5 |
| S2 | S2 | S2 |
| S2 ERC | S2 ERC | S2 ERC |
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C | SD4 | SD4 | SD4 |
| S3 | S3 | S3 |
| S3 ERC | S3 ERC | S3 ERC |
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D | SD3 | SD3 | SD3 |
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E | SD2 | SD2 | SD2 |
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F | SD1 | SD1 | SD1 |
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G | NTC | NTC | NTC |
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H | NEG | NEG | NEG |
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注：该表示例的是检测 6 个浓度梯度的 CHO control DNA 标准曲线(SD1-SD6) 、1 个无模 板对照 NTC、1 个阴性质控 NEG、3 个待测样本(S1-S3)和每个样本的 ERC(S1 ERC-S3 ERC)。 每个检测做 3 个重复孔。
4. 将 96 孔板用光学膜封闭，轻微振荡混匀，短时间快速离心后放入 qPCR 仪中。
PCR试剂盒cccDNA染料检测qPCR 程序参数设置(以 ABI 7500 为例)：
1.创建空白新程序，选择绝对定量检测模块。
2.创建新检测探针，命名为 CHO-DNA，选择报告荧光基团为 FAM，淬灭基团为 none,检测 参比荧光为 ROX。
3.设置两步法反应程序： 95oC 预变性 10min；95oC 10 sec，60oC 1min，40 个循环； 反应体积为 30ul。
qPCR 结果分析(以 ABI 7500 为例)
1.在 Results 的 Amplification plot 面板中， 将 Threshold 设置为 0.05 ，点击 Analyze，此时可 初步查看扩增曲线的形态是否正常。
2.在 Results 的 Plate 面板中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为 Standard，并且在 Quantity 一栏分别赋值为 3000 、300 、30 、3 、0.3 、0.03 (含义为每孔的 DNA 量， 单位为 pg)， 并且
在相应的 Sample Name 一栏命名为 SD1 、SD2 、SD3 、SD4 、SD5 、SD6。
3.在 Results 的 Plate 面板中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将阴性质控 NEG 孔、待测样本孔、样本 ERC 孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 NTC 、NEG 、S 、ERC ，之后点击开始键。
4.在 Results 的 Standard Curve 面板中，可读取标准曲线的斜率(Slope)、截距(Intercept)、R2 。
5.在 Results 的 Report 面板中， Mean Quantity 一栏可读取无末班对照 NTC、阴性质控 NEG、 待测样本、样本 ERC 的检测值。后续可在检测报告中将单位换算为 pg/ml 样本。
注:根据待测样本和样本 ERC 的检测结果计算加样回收率，加样回收率要求在 50%- 150%之 间。
