羧酸酯酶（carboxylesterase，CarE）活性测定试剂盒说

羧酸酯酶（carboxylesterase，CarE）活性测定试剂盒说明书

                                                      分光光度法50管/48样

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

羧酸酯酶（carboxylesterase，CarE）活性测定试剂盒说测定意义：

哺乳动物CarE，也称脂族酯酶（aliesterase），广泛分布于组织和器官，属于丝氨酸水解酶家族。CarE催化含酯键、酰胺键和硫酯键的内源性与外源性物质水解，但不能催化水解乙酰胆碱及其类似物。CarE参与脂质运输和代谢，并且与多种药物、环境毒物以及致癌物的解毒和代谢有关，有机磷农药可结合并且抑制CarE活性。

测定原理：

CarE能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯，固蓝显色；在450 nm光吸收增加速率，计算CarE活性。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体30mL×2瓶， 4℃保存；

试剂三：粉剂×2支， 4℃保存，临用前取1支试剂三，加1.2ml无水乙醇充分溶解；

试剂四：粉剂×2支，-20℃保存，临用前取1支试剂四，加少量试剂二溶解；

工作液配制：临用前配制，向1瓶试剂二中，加入溶解后的试剂三和试剂四各1支，充分溶解，过滤，4℃避光保存，可用1周。

羧酸酯酶（carboxylesterase，CarE）活性测定试剂盒说样本的前处理：

1、细菌、细胞样品制备

收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每200万细菌或细胞加入400μL试剂一，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000g 4℃离心30min，取上清液待测。

2、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆；12000g 4℃离心30min，取上清液待测。

3、液体：直接测定。

测定步骤：

1. 分光光度计预热30min，调节波长到450 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于37℃水浴中预热30 min。

3. 空白管：取1mL玻璃比色皿，依次加入5μL蒸馏水和1000μL试剂二，迅速混匀，于450nm处测定3min内吸光值变化，第10s吸光值记为A1，第190s吸光值记为A2。△A空白管=A2-A1

4. 测定管：取1mL玻璃比色皿，依次加入5μL上清液和1000μL试剂二，迅速混匀，于450nm处测定3min内吸光值变化，第10s吸光值记为A3，第190s吸光值记为A4。△A测定管=A4-A3

注意：空白管只需测定一次。

CarE活性计算公式：

1 组织中CarE活性

（1） 按照蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白在37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加1定义为1个酶活单位。

CarE酶活(U/mg prot)= (△A测定管-△A空白管) ×V反总÷(Cpr×V样)÷T

= 67×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr

Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；V样：加入上清液体积，0.005 mL；T：反应时间，3min。V反总：1.005mL；蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。

（2） 按照样品质量计算

单位的定义：每g组织在37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加1定义为1个酶活单位。

CarE酶活(U/g 鲜重)= (△A测定管-△A空白管) ×V反总×（V样总÷V样）÷W÷T

= 67×(△A测定管-△A空白管)÷W

V样总：上清液总体积，1 mL；V样：加入上清液体积(mL)，0.005 mL；V反总：1.005mL；W：样品质量（g）；T：反应时间（min），3min。

2 细菌或细胞中CarE活性

单位的定义：每1万个细菌或细胞在37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加1定义为1个酶活单位。

CarE酶活(U/10⁴ cell)= (△A测定管-△A空白管) ×V反总×（V样总÷V样）÷细胞密度（10⁴ cell/mL）÷T

= 67×(△A测定管-△A空白管)÷细胞密度（10⁴ cell/mL）

V总：上清液总体积，1 mL；V样：加入上清液体积(mL)，0.005 mL；V反总：1.005mL ；T：反应时间（min），3min。

3. 液体中CarE活性

单位的定义：每毫升样品在37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加1定义为1个酶活单位。

CarE酶活(U/mL )= (△A测定管-△A空白管) ×V反总÷V样÷T

= 67×(△A测定管-△A空白管)

V样总：上清液总体积，1 mL；V样：加入上清液体积(mL)，0.005 mL；V反总：1.005mL；T：反应时间（min），3min。