果糖(fructose ,FT)含量试剂盒说明书
分光光度法50管/48样
注 意 :正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
果糖(fructose ,FT)含量试剂盒测定意义:
果糖是一种最为常见的己酮糖,是葡萄糖的同分异构体,以游离状态大量存在于水果的浆汁和蜂蜜中,能与葡萄糖结合生成蔗糖。果糖是最甜的单糖,广泛应用于食品、医药、保健品生产中。
还原糖含量试剂盒测定原理:
果糖与间苯二酚反应,生成有色物质,在480nm下有特征吸收峰。
所需的仪器和用品:
可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、蒸馏水
试剂的组成和配制
还原糖含量试剂盒说明书
分光光度法50管/24样
注 意 :正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
还原糖含量试剂盒测定意义:
还原糖广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。植物体内的还原糖主要包括葡萄糖、果糖和麦芽糖等,是最常见的单糖和双糖,其中葡萄糖和果糖不仅是呼吸作用的主要底物,也是进一步合成蔗糖、淀粉和纤维素的底物。
测定原理:
加热促进碱性溶液中3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖生成棕红色氨基化合物,在540nm有特征吸收峰;在一定的浓度范围内,还原糖含量与540nm吸光度成线性关系,根据标准曲线,即可求出样品中还原糖的量。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、蒸馏水。
试剂的组成和配制:
试剂一:100mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:15mL×1瓶 ,4℃保存;
样品中还原糖的提取:
1、细菌或细胞的处理:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议1000万细菌或细胞加入2mL试剂一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3S,间隔10S,重复30次),转移到有盖离心管中(防止加热时水分散失),80℃水浴中40min并且振荡8~10次,8000g,25℃离心10min,取上清供测定用。
2、组织的处理:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.2g组织,加入2mL试剂一),冰浴匀浆,转移到有盖离心管中(防止加热时水分散失),80℃水浴中40min并且振荡8~10次,8000g,25℃离心10min,取上清供测定用。
3、血清(浆)的处理:按照血清(浆)体积(mL):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议取0.2mL血清(浆)加入2mL试剂一),冰浴匀浆,转移到有盖离心管中(防止加热时水分散失),80℃水浴中40min并且振荡8~10次,8000g,25℃离心10min,取上清供测定用。
测定步骤:
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至540nm,蒸馏水调零。
2、 调节水浴锅至95℃。
3、 在EP管中加入下列试剂:
试剂(μL) | 对照管 | 测定管 |
样本 | 700 | 700 |
试剂二 |
| 500 |
蒸馏水 | 500 |
|
将各管摇匀,在95℃水浴中加热5min(盖紧,防止水分散失),取出后立即冷却至室温,混匀。在540nm波长下读取对照管和测定管吸光值。计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。
注意:如果ΔA大于2,需要将样本用试剂一稀释,计算公式中乘以相应稀释倍数(若显色后出现分层现象,可改用蒸馏水稀释)。
还原糖含量计算:
1、标准条件下测定回归方程为y = 8.3796x- 0.3034;x为标准品浓度(mg/mL),y为吸光值。
2、按样本鲜重计算:
还原糖(μg/g鲜重)=[1000×(ΔA+0.3034)÷ 8.3796×V1]÷(W×V1÷V2)=238.67×(ΔA+0.3034)÷W
3、按样本蛋白浓度计算:
还原糖(μg/mg prot)=[1000×(ΔA+0.3034)÷ 8.3796×V1]÷(V1×Cpr)=119.34×(ΔA+0.3034)÷Cpr
4、按细菌或细胞密度计算:
还原糖(μg /104 cell)=[1000×(ΔA+0.3034)÷ 8.3796×V1]÷(1000×V1÷V2)=0.239×(ΔA+0.3034)
5、按血清(浆)体积计算:
还原糖(μg/mL)=[1000×(ΔA+0.3034)÷ 8.3796×V1]÷(V3×V1÷V2)=1193.4×(ΔA+0.3034)
1000:1mg/mL=1000µg/mL;V1:加入样本体积,0.7mL;V2:加入提取液体积,2 mL;V3:加入血清(浆体积),0.2mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;1000:细菌或细胞总数,1000万。
注意:最低检测限为1mg/g鲜重或10μg/mg p
:
提取液:液体 100ml×1瓶,4℃保存;
试剂一:1mg/mL标准液10mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:液体 40ml×1瓶,4℃保存;
试剂三:液体 15ml×1瓶,4℃避光保存;
试剂四:粉剂0.5g×1瓶,常温保存。
果糖提取:
称取0.1~0.2g样本,常温研碎;加入1mL提取液,适当研磨后快速转移到有盖离心管中;置于80℃水浴锅中10min(盖紧,以防止水分散失),振荡3~5次,冷却后,4000g,25℃离心10min,取上清;加入少量(约2mg)试剂四,80℃脱色30min(盖紧,以防止水分散失);再加入1mL提取液,4000g,25℃离心10min,取上清液测定。
果糖(fructose ,FT)含量试剂盒测定步骤:
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至480nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定(在1.5mL EP管中依次加入下列试剂):
试剂(μL) | 空白管 | 标准管 | 测定管 |
样本 |
|
| 100 |
试剂一 |
| 100 |
|
蒸馏水 | 100 |
|
|
试剂二 | 700 | 700 | 700 |
试剂三 | 200 | 200 | 200 |
混匀,95℃水浴反应30min(盖紧,以防止水分散失),冷却后测定480nm处光吸收值,空白管、标准管和测定管分别记为A1、A2和A3。
果糖含量计算:
1、果糖含量(mg/mg prot)=(C标准管×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1) ÷(V1×Cpr)= (A3-A1)÷(A2-A1) ÷Cpr
此法需要自行测定蛋白浓度。
2、果糖含量(mg/g鲜重)=(C标准管×V1)×(A3-A1) ÷(A2-A1) ÷(W×V1÷V2)= 2× (A3-A1) ÷(A2-A1) ÷W。
C标准管:标准管浓度,1mg/mL;V1:加入样本体积,0.1mL;V2:加入提取液体积,2mL; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g。
注意:最低检测限为100ng/g鲜重或1ng/mg