丙酮酸磷酸双激酶（PPDK)试剂盒

丙酮酸磷酸双激酶（PPDK)试剂盒说明书

                                       分光光度法 50管/48样

注   意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

丙酮酸磷酸双激酶（PPDK)试剂盒测定意义：

丙酮酸磷酸双激酶（pyruvate phosphate dikinase, PPDK, EC 2.7.9.1）是C4途径和景天科酸代谢途径的限速酶，催化ATP、丙酮酸和Pi经三步反应生成磷酸烯醇式丙酮酸。该酶主要存在于C4植物的叶绿体基质中，对光合功能具有重要调节作用。

测定原理：

PPDK的逆向反应催化磷酸烯醇式丙酮酸、AMP和PPi生成丙酮酸、ATP和Pi，乳酸脱氢酶进一步催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD⁺，在340nm测定NADH减少速率，计算PPDK活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：60mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体60 mL×1瓶， 4℃保存；

试剂二：粉剂×2瓶，-20℃保存；

试剂三 ：液体60μL×1支，4℃保存；体积较少，若沾在管壁上，临用前可低速离心后使用。

样本的前处理： 

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

丙酮酸磷酸双激酶（PPDK)试剂盒测定步骤和加样表：

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 样本测定

（1）工作液的配制：临用前取试剂二一瓶加入25mL试剂一和12.5μL试剂三，充分混匀，置于37℃水浴5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

（2）在1mL石英比色皿中加入50μL样本和950μL工作液，混匀，立即记录340nm处初始吸光值A1和37℃反应5min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

丙酮酸磷酸双激酶（PPDK)试剂盒PPDK活性计算：

（1）按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PPDK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PPDK（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T=643×ΔA÷W

V反总：反应体系总体积，1×10^-3 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。