腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGP）活性测定试剂盒

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGP）活性测定试剂盒说明书

                                     
                                                                       分光光度法 25管/24样

注    意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸与ATP反应生成淀粉合成的直接前体ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGP）活性测定试剂盒测定原理：

AGP催化的逆向反应生成G1P，在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下测定NADPH增加速率，即可计算AGP活性。

需自备的的仪器和用品：

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水

试剂的组成和配制：

提取液：液体25mL×1瓶，4℃保存;

试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入9mL蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂三：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入5mL蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

粗酶液制备：

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGP）活性测定试剂盒测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、试剂一置30℃保温10min以上。

3、在EP管中按顺序加入下列试剂

混匀，30℃保温15 min，置沸水浴中1 min（盖紧，防止水分散失），冰浴迅速冷却后，4000g4℃离心5min，取上清液，在1mL石英比色皿中依次加入下列试剂

混匀后，立即于340 nm波长下记录初始吸光度A1和 2min后的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGP）活性测定试剂盒AGP活性计算：

1、按样本蛋白蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活性单位。

AGP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T×稀释倍数

                =2813×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按照样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

AGP（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V样÷V样总）÷T×稀释倍数

                =2813×ΔA÷W

V反总：反应体系总体积，1×10^-3 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.04mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；稀释倍数：1.4；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量。

一．试剂配制

1、标准溶液

盐酸标准溶液[c (HCl)=0.1000 mol/L]，移取9 mL 浓盐酸（盐酸浓度36%～38%）用蒸馏水稀释并定容至1000 mL容量瓶，摇匀，用无水碳酸钠进行标定。

无水碳酸钠标定方法：取50mL蒸馏水，加入10滴溴甲酚绿-甲基红混合指示剂，用配置好的盐酸溶液滴定至溶液由变为暗红色，消耗盐酸体积记为V₀；再准确称取经300℃烘干1小时的无水碳酸钠0.2g，精确至0.0001，记为m，溶于少量蒸馏水中定容至50mL，加入10滴溴甲酚绿-甲基红混合指示剂，用配置好的盐酸溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色，煮沸3分钟，冷却后继续滴定至溶液呈暗红色，消耗盐酸体积记为V。

C（HCl）=m/[(V-V₀)*0.05299],其中C（HCl）单位为mol/L。

2、40%氢氧化钠溶液1000 ml（400 g/L）

400g氢氧化钠溶解于1000mL无氨蒸馏水中；

3、2%浓度硼酸溶液2000 ml （20g/L）

分析纯硼酸40g溶于2000ml无氨蒸馏水中；

4、甲基红-溴甲酚绿混合指示剂

A：称取0.1g 甲基红，用无水乙醇定容至100 ml；

B：称取0.1g 溴甲酚绿，用无水乙醇定容至100 ml.

临用时按照A:B=1:5混匀。取10ml加入1000ml硼酸溶液中。

5、高锰酸钾溶液：2.5g高锰酸钾溶于50mL蒸馏水中。

6、1:1硫酸溶液：100mL浓硫酸缓慢加入100ml蒸馏水中，边加边搅拌。

二．样品消解

1. 将植物样本粉碎，80℃烘干至恒重，过40目筛，称取约0.3g，加入消化管中，同时取空消化管两支，用移液管分别往每管中加入10mL浓硫酸，轻轻晃动消化管。

2. 将20支消化管全部置于石墨消解仪上，盖好盖子，打开废气回收系统以及石墨消解仪，温度设置为：曲线加热100℃，10min；280℃，10min；400℃，40min。

3. 取出消化管冷却至室温，切勿在样品冷却之前开盖。每支消化管中缓慢加入1mL过氧化氢，摇匀，重新

放置在石墨消解仪上，温度设置为：曲线加热200℃，10min；320℃，30min；400℃，30min。

4. 取出消化管冷却至室温，切勿在样品冷却之前开盖。每支消化管中缓慢加入0.5mL过氧化氢，摇匀，重新放置在石墨消解仪上，温度设置为：曲线加热200℃，10min；320℃，30min；400℃，60min。若样本未呈现澄清状态，应继续加热至澄清，即消解完全。

5. 关闭石墨消解仪，待样品冷却后关掉废气回收系统。

三．全氮测定

1. 将滴定酸桶，硼酸桶，碱桶，蒸馏水桶管路按照标示插好（滴定酸桶的管子应插到底部），将硼酸桶，碱桶，蒸馏水桶的液位检测插好。

2. 打开定氮仪与循环水系统，进入清洗界面，先进行两次硼酸清洗管路，再进行一次换酸清洗，一次碱管路清洗。

3. 装一只空的消化管，关好防护门。点击【测试】菜单系统自动进入操作模式界面，选择【自动测试】，常规，设置参数为：样品编号；样品重量：0.000g。滴定酸浓度：标定好的盐酸浓度(mol/L)；空白值：0.000mL；蛋白系数：样品固定的转换系数。硼酸：15ml；稀释水：20mL；碱液：0mL；蒸馏：5min；设置完成后，点击【确定】即可进入自动测试功能。

4. 测试完成后打印测定结果。

5. 打开安全门，戴棉质手套取出消化管，放入样品空白管，关好防护门。点击【测试】菜单系统自动进入操作模式界面，选择【自动测试】，常规，碱液参数设置为40mL，其余参数同步骤3，重复步骤3。

6. 样品测定：设置参数为：样品编号；样品重量：称取的样品实际质量，g。滴定酸浓度：标定好的盐酸浓度(mol/L)；空白值：两支空白管滴定用酸量的平均值，mL；蛋白系数：样品固定的转换系数。硼酸：15ml；稀释水：20mL；碱液：40mL；蒸馏：5min；设置完成后，点击【确定】即可进入自动测试功能。

7. 测试完成后打印测定结果。

8. 进行仪器清洗，然后关闭循环水系统及定氮仪，然后清洁仪器。

四．注意事项

1. 禁止使用边缘有缺口，或者有裂缝的消化管进行消解，消解时盖子放置好，以免废气泄露，消解仪工作状态尽量不要靠近仪器，但是要经常观察管内变化，若出现异常情况，立即断电。

2. 开始蒸馏时，消化管中液体的总体积以不超过总体积的1/3。

3. 拿取消化管时，注意高温烫伤。放置消化管时，左右旋转几下，确保消化管与蒸馏头密封。

4. 每日做完实验要用洗瓶冲洗蒸馏头残余碱液，仪器前部的槽皿中，如果积有液体，请擦洗干净。

5. 为了延长防溅装置的使用寿命，请每天工作结束后清洗两次左右：即消化管加水150mL空蒸5分钟。（空蒸仪器把加碱量设置为“0”）。

6. 关机前，需将接收杯内液体排净，仪器使用结束后要关闭水源、电源，仪器上要放置一空消化管（防止防溅装置内残留液体流到仪器上）。

7. 做完实验将消解管清洗干净（包括壁内和壁外），然后放烘箱烘干，烘干后若长时不用则收起来。消解仪各部位上若有硫酸残留需及时擦拭干净一面被腐蚀，消解仪盖子以及托盘需长清洗保持洁净。