NADPH-细胞色素C还原酶（ NCR）试剂盒

NADPH-细胞色素C还原酶（ NCR）试剂盒说明书

          分光光度法  50管/48样

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。NCR作为P450酶系的重要一员，催化氧化型P450还原再生。

测定原理：

NCR催化NADPH还原氧化型细胞色素c生成还原型细胞色素c，还原型细胞色素c在550nm处有特征吸收峰；通过测定550nm吸光度的增加速率，来计算NCR活性。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。

NADPH-细胞色素C还原酶（ NCR）试剂盒组成和配制：

试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加100mL蒸馏水充分溶解。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶，-20℃保存。临用前配制，加2.6 mL蒸馏水充分溶解，4℃保存。

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前配制，加550 μL蒸馏水充分溶解，4℃保存。

粗酶液提取：

1、除去细胞核和线粒体等：称约0.5g组织，加入4℃预冷的1 mL试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4℃离心30min，取上清液，转移到超速离心管中。

2、粗制微粒体：4℃，100 000g，离心60min，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1 mL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min，弃上清液。

4、最终微粒体：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5 mL，盖紧后充分震荡溶解，4℃保存待测。

测定操作：

1. 分光光度计预热30 min，调节波长到550 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二在37℃水浴中预热30min。

3. 空白管：取1mL玻璃比色皿，依次加入50μL蒸馏水、900μL试剂二、50μL试剂三和10μL试剂四，迅速混匀后于550nm处测定2min内吸光值变化，第10 s和第130 s吸光值分别记为A1和A2，△A空白管=A2-A1。

4. 测定管：取1mL玻璃比色皿，依次加入50μL粗酶液、900μL试剂二、50μL试剂三和10μL试剂四，迅速混匀后于550nm处测定2min内吸光值变化，第10 s和第130 s吸光值分别记为A3和A4，△A测定管=A4-A3。

注意：空白管只需要做一次。

计算公式：

(1).按照蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中，每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素C为1个酶活单位。

NCR酶活性 (nmol/min/mg prot)= (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总÷（Cpr×V样）÷T

= 529×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr

(2)按照样本质量计算

活性单位定义：37℃中，每克样品每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素C为1个酶活单位。

NCR酶活性(nmol/min/g 鲜重)= (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总÷（W×V样÷V样总）÷ T

= 265×(△A测定管-△A空白管)÷W

ε：还原型细胞色素C摩尔消光系数，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，1010μL=0.00101L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL，需要另外测定；V样：加入反应体系中上清液体积，50μL=0.05mL；V样总：加入提取液体积，0.5mL；W：样本质量，g；T：反应时间，2min。

NADPH-细胞色素C还原酶（ NCR）试剂盒注意事项：

试剂三、试剂四临用前配制，配好未使用完的4℃可保存两天。