柑橘顽固病螺原体染料法荧光定量PCR试剂盒

【柑橘顽固病螺原体染料法荧光定量PCR试剂盒利用PCR原理，定性检测病毒，对病毒引起的疾病诊断及疗效评估有重要指导意义。

【检验原理】

利用离心柱内硅基质膜提取RNA，在反转录酶的作用下，以RNA为模板，以引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在TaqDNA聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火、中温延伸的循环，使特异DNA片段的拷贝数放大一倍。经过35次循环，最终使扩增DNA片段放大了数百万倍。将扩增DNA片段进行电泳，经染色后，在紫外灯照射下，肉眼可见到DNA片段的扩增带。

【主要组成成份】

注：阴性对照为基因组DNA，阳性对照为失去活性的猫冠状病毒cDNA。

【储存条件及有效期】-20℃以下保存，避免反复冻融，有效期12个月。

【需自备的物品】PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪、可调移液器、琼脂糖等相关试剂及设备。

【注意事项】

1.病毒具有很强的感染能力，操作前必须准备好各种防御措施。

2.操作时须严格按照步骤进行，废物必须放入含消毒液的废物缸，以免污染实验室和工作人员。

3.为避免其他核酸的污染而出现假阳性，必须使用不含DNA和RNA的离心管、吸管、枪头、试剂和手套，操作人员须戴口罩。

【实验准备】

如果是提取病毒RNA，请选用RNase free Tip枪头和1.5 ml离心管或将枪头和离心管用0.1% DEPC水处理后再使用。

【柑橘顽固病螺原体染料法荧光定量PCR试剂盒操作步骤】

1.样品处理

(1). 适用标本类型：发病动物血液、空肠及小肠肠内容物及组织脏器(肠道组织、肠系膜及淋巴结等)和病毒培养液。

(2). 标本采集，方法如下：

a.血清：用一次性注射器取静脉血2-3ml，转至5ml 的干燥管中，密闭送检。

b.肠内容物：无菌条件下取肠道内容物约1g 左右，置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理盐水)的5ml 离心管中，立即送检。

c.组织脏器：取发病动物肠道组织及肠系膜淋巴结等组织约1g，置一1.5ml的洁净离心管中，密闭送检。

(3).应避免标本间交叉污染。

(4).标本收集后可立即检测；若不能立即检测，可置于2～8℃冷藏过夜保存；如需长期保存，标本应冻存于-80℃以下，避免反复冻融。

2. 提取过程

用QIAGEN、Roche公司RNA提取试剂盒提取RNA，具体操作按照其试剂盒说明书操作。

3. RT-PCR扩增

（1）每份总体积20 µL，含15 µL RT-PCR反应液（用前混匀），3µL 混合酶液，2 µL模板RNA。

例如：n份样品，配制n+1份，15×（n+1）RT-PCR反应液， 3×（n+1）混合酶液匀后取18 µL分装成n份，分别加入2 µL模板RNA，作好标记。

（2）在PCR扩增仪上进行以下程序：50 ℃ 10 min，94 ℃ 3 min；循环94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35次；再72 ℃延伸7 min。

4. 电泳

称1.5 g琼脂糖放于500 mL锥形瓶中，加入1倍TAE电泳缓冲液100 mL（取2 mL 50倍TAE电泳缓冲液，用双蒸水稀释至100 mL），于微波炉中熔解，待冷却至50℃左右再加入50 µL染色液（自备）混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增产物中加入4µL上样缓冲液（自备）混匀后取10 µL点样于琼脂糖凝胶孔中，以110～120V电压于1倍TAE电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。（注：染色液是2000×，上样缓冲液是6×）

【结果判定】

阳性对照出现191 bp扩增带、阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立。被检样品出现191 bp扩增带为猫冠状病毒阳性，否则为阴性。

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