小鼠视网膜色素上皮原代细胞

小鼠角膜上皮原代细胞培养操作

取新生1天的SD大鼠，在无菌条件下用眼科剪剪除背部皮肤，剪去全部脊椎，将脊椎腹侧朝下置于灭菌毛玻璃片上。在解剖显微镜下，沿椎管两侧水平剪除背侧一半椎骨，暴露脊髓和神经节。用微解剖镊剥离脊髓后，从椎间孔中挑出背根神经节，置于盛有预冷PBS液的灭菌玻璃平皿中，剥除神经节被膜后，用1ml移液器将神经节移入15ml离心管中，PBS离心漂洗2次。离心管中加入4ml 0.125%胰蛋白酶，吹打、混悬神经节，置于37℃培养箱中孵育20min，加入4ml DMEM完全培养基终止消化，离心漂洗2次后，再加入2ml Neurobasal培养基(含4.5g/L D-葡萄糖，2mmol/L L-谷氨酰胺、1%FBS、20ml/L B-27添加剂、10ug/ml NGF、青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml)。移液器反复吹打20-30次，使背根神经节细胞尽可能分散，经200目不锈钢网过滤，制成细胞悬液，接种于预先涂有PLL的细胞培养板中，接种密度为2-3x105/ml细胞，置于37℃、5% CO2培养箱培养中静置培养，每周换液2次。

小鼠视网膜色素上皮原代细胞处理及主要试剂

SD大鼠(新生1d)，购自武汉大学中南医院动物实验中心；

NGF购自PeproTech公司；

Neurobasal培养基、DMEM、胎牛血清(FBS)、B-27添加剂(50X)购自Gibeo公司；

L-谷氨酰胺、多聚赖氨酸(PLL)胰蛋白酶购自Sigma公司；

胰蛋白酶购自AMRESCO公司；

双抗（青、链霉素）购自HyClone公司

小鼠视网膜色素上皮原代细胞传代培养操作

1、 细胞贴壁生长，铺满瓶底80%左右或有细胞堆叠生长时即可传代；

2、弃去原瓶培养液，用PBS清洗1~2次，加入3~4ml新鲜培养液，用细胞刮沿一个方向依次将瓶底细胞刮下，不要反复来回刮，对细胞损伤较大。刮完后可在镜下观察，若细胞团较多可用吸管轻轻吹散。也可直接用吸管吹打收集细胞，一般会有部分细胞吹不下来，可收集吹下来的部分细胞进行培养，切忌吹打过度。

3、将收集到的细胞按一定比例分装到新的培养瓶中培养，一般3~4h内大部分细胞都会贴壁，若细胞碎片较多可在细胞贴壁后换液除去。

1. 确保所有实验室材料都无菌

交叉污染是细胞培养的大敌。即使是最轻微的污染，也可能毁了几个星期的成果。因培养箱内温暖潮湿，真菌极易生长，因此必须注意定期清洁。此外，在将 培养瓶、移液管及其他的相关物品放入超净台之前，应用酒精擦拭干净，以避免污染。

2. 小心处理您的培养物

细胞培养的脆弱性怎么强调也不为过。 剧烈摇晃，或连续的温度波动可能会对生长产生不利的影响。确保培养箱是水平的，温度均一，且远离电动仪器。此外， 尽量避免一次处理多个细胞系，因为它可能会影响细胞的基因型和表型。您还应定期完成STR图谱分析，以确认细胞系的身份。

3. 在使用前正确解冻细胞

尽管解冻看起来是个简单的步骤，但必须操作得当，以免伤害细胞。长时间暴露在高温条件下会使细胞无法铺板。因此，冻存管应当在37°C水浴中放置2分钟，然后用条件培养基稀释，以避免DMSO造成直接伤害。

4. 使用对数生长期的细胞

细胞培养过程共有3个阶段：停滞期、 对数期和平台期，分别代表了低细胞生长、高细胞生长和无细胞生长。最有活力的细胞是健康的，快速分裂的，在对数期以70-80%的汇合度存在。

5. 在传代之前不要让细胞完全汇合

汇合度是指贴壁细胞占据培养瓶表面积的比例。完全汇合意味着100%的表面都被贴壁细胞覆盖。一定要避免这种状态，因为它意味着细胞不能继续生长。不过，当务之急是使用活跃生长的细胞。

6. 选择的培养基开发策略

在细胞培养过程中，培养基是控制产品质量、产量和成本的最重要因素。必须针对每种培养物来定制培养基，以优化实验结果。在决定以哪种方式来开发您的培养基时，您有几个选择。您可以购买现成的，自己开发，也可以与另一家公司合作开发特定的培养基。在这个过程中，您需要考虑时间和成本等因素。

7. 配制干粉培养基时评估水的质量

液体培养基往往会带来比干粉培养基更高质量的结果。这可能与水的质量有关。由于细菌在水中迅速生长，故需要监控内毒素及其他污染物。专业公司有资源来控制细菌生长，比如过滤器。因此使用专业化生产的液体培养基会更加可靠一点。

8. 利用细胞的代谢特性来优化培养基

分析使用过的培养基，有助于鉴定必要成分的代谢速率，包括氨基酸和维生素。从细胞生长阶段和蛋白生产阶段收集到的动态代谢图谱可用来平衡基础培养基和添加培养基，指导培养基的重点。

9. 避免细胞的过度消化

胰蛋白酶通过消化负责让细胞与容器结合的蛋白质，而实现贴壁细胞的传代。如果细胞暴露在胰酶中时间太长，则胰酶将开始切割细胞表面蛋白，这会影响细胞行驶正常功能的能力。

10. 培养基中不要一直使用抗生素

随着细胞培养物更加频繁地暴露在抗生素中，对抗生素有着天然耐药性的菌株将开始出现。这种现象可掩盖潜在的污染，这对实验是非常有害的。

小鼠视网膜色素上皮原代细胞注意事项

1、 培养过程中要尽量减少热源的接触，建议用一次性使用的瓶皿培养，一切与细胞接触的器具要进行去热源处理，建议使用进口血清；

2、传代时吹打不宜过度，吹下来的细胞足够传代即可，不要反复吹打；

3、细胞生长速度很快，一般1~2天要传一次代，密度达到80%左右即可传代，可以适当降低接种密度，但密度较低时细胞会成堆生长，当出现细胞堆叠生长时也应当传代；

4、若没时间处理细胞，为避免细胞长过，可适当降低血清浓度（不低于5%）以减缓细胞生长速度，但不宜长期低血清培养，一般需正常培养1~2代以恢复其状