人肺大动脉内皮原代细胞运输和保存：干冰运输及复苏好存活细胞：（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。（2）T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

细胞接收后的处理：

1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。  收到细胞后次传代建议T25培养瓶1：2传代 。

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM 基础培养基            81%      

优质胎牛血清                  15 %

GlutaMAX-1谷氨酰胺            1 %

MEM NEAA非必需氨基酸          1%

Sodium Pyruvate丙酮酸钠       1%

P/S青霉素-链霉素              1%

β-巯基乙醇                 0.5ul（1000X)

LIF                        5ul（10ng/mL）

培养瓶用0.1%明胶包被，或者使用昆明白MEF作为饲养层细胞。

2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：完全培养液 60%%，FBS 30%%，DMSO 10%%现用现配。

我库冻存时，体积为 500 μl，预期存活率 70%，每支冻存管的细胞复苏，3 至4 天后，会形成 30 至 40 个克隆，建议复苏至 1 个 T25 培养瓶中。

二：细胞处理：

人肺大动脉内皮原代细胞铺制：

1. 在 T25 培养瓶中加入 0.2%明胶，摇匀后覆盖底面即可，于 37℃细胞培养箱至少放置 15 min 以上。

2. 吸除 0.2%明胶，加入事先水浴加热至 37℃的 MEF 完全培养液。一般地，一个 T25 培养瓶中加入 5 ml MEF 完全培养液。

3.  按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用 KM-r P3 MEF 或 CF-1 P3 MEF；复苏 MEF 细胞若干支。将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用 75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。

4. 将冻存管内细胞悬液转移至含 2 ml MEF 完全培养液的 15 ml 离心管内，以1000 rpm，离心 5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的 MEF 完全培养液 1 ml，重悬后按照一个 T25 培养瓶铺 1´106 的 MEF 细胞，平均加入到 T25 培养瓶中，轻轻摇匀后置于 37℃细胞培养箱。24 h 以后可以传入小鼠胚胎干细胞

5.复苏或传代小鼠胚胎干细胞前，将 T25 培养瓶中的 MEF 完全培养液吸除，加入 2 ml 小鼠胚胎干细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞完全培养液待用。

复苏：

1.将小鼠胚胎干细胞冻存管从液氮中取出，置于 37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用 75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。

2. 将冻存管内细胞悬液转移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干细胞完全培养液的 15 ml 离心管内，以 1000 rpm，离心 5 min。

3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞完全培养液 2 ml，吹打悬浮。

4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。

5.  转移至 1 个已经铺好 MEF 细胞的 T25 培养瓶中培养。

6. 每天更换小鼠胚胎干细胞完全培养液。

传代：

1. 一般在复苏后第 2-3 天传代，视克隆大小和密度而定

2. 吸除废液。

3. 用 PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。

4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶（含 EDTA）至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖底面，置于 37℃培养箱内消化细胞。

5. 在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落（一般需要 1-2 min）。

6.  加 2 ml 小鼠胚胎干细胞完全培养液终止消化。

7.  以 1000 rpm，离心 5 min，弃上清。

8. 加入约 1 ml 小鼠胚胎干细胞完全培养液，多次轻轻吹打细胞， 制成单细胞悬液。

9. 加入足量的小鼠胚胎干细胞完全培养液，吹打混匀，细胞悬液分装到铺好 MEF 细胞的 T25 培养瓶中。一般地，一个 T25 培养瓶加入 5-6 ml 培养液。放入 37℃培养箱内培养。每天换液。传代比例：1:4-1:7

冻存：

1.按传代的方法将细胞消化下来，制成细胞悬液。

2.  以 1000 rpm，离心 5 min，弃上清，逐滴加入已经预冷的冻存液，悬浮细胞。

3. 按每支存管内加入 500 ml 细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。

4. 将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。冻存液配方：

小鼠胚胎干细胞完全培养液 60%，ES 级 FBS 30%，DMSO 10%

附：人肺大动脉内皮原代细胞分离的简易方法（差速贴壁法）：

1.培养中的小鼠胚胎干细胞，按传代的操作方法将细胞用胰酶消化并吹打成单细胞悬液后，加入适量的提前温育好的小鼠胚胎干细胞完全培养液重悬细胞， 吹打混匀，细胞悬液分装到无 MEF 细胞的培养皿或培养瓶（一般地，一个T25 培养瓶中培养的小鼠胚胎干细胞，在一个 10 cm 培养皿中进行差速贴壁。不要事先铺明胶，如铺明胶则细胞贴壁速度过快无法有效分离小鼠胚胎干细胞与 MEF 细胞）中。

2. 培养皿或培养瓶置于 37°C 培养箱内静置 1 小时。

3.  1 小时后，绝大部分 MEF 细胞已贴在培养皿或培养瓶底面，而大部分小鼠胚胎干细胞仍然悬浮在培养液中。收取培养液，进行后续实验。

人肺大动脉内皮原代细胞