艾美捷一氧化氮检测荧光分析试剂盒

无机离子在自然界中起着许多生理作用。阳离子和阴离子参与神经传递、肌肉收缩、细胞内水分运输、血液中的酸碱平衡、骨形成、能量传递和储存。此外，它们作为辅助因子发挥作用，或者可以作为其它重要生物分子中的部分被发现。

艾美捷 BioVision 一氧化氮荧光检测试剂盒可提供准确、可靠的检测结果在一个简单的两步过程中方便地测量总硝酸盐/亚硝酸盐浓度。

硝酸盐+亚硝酸盐的测量：

1.标准品制备：添加5µl重组10 mM硝酸盐/亚硝酸盐标准品在995µl分析缓冲液中，旋涡产生50µM工作标准溶液。加0,4,，将8、12、16、20µl工作标准加入6个连续井中，生成0、200、400，6008001000pmol/井标准。使用分析缓冲液使体积达到75µl。

注意：DAN探针与亚硝酸盐而非硝酸盐反应。对于常规总亚硝酸盐/硝酸盐测定，只能制备硝酸盐标准曲线。但是，如果需要测量亚硝酸盐和硝酸盐浓度单独使用时，可在标准曲线和分析样品中没有硝酸还原酶。硝酸盐=总量-亚硝酸盐。

2.制备样品：可能需要过滤含有高蛋白浓度的样品在分析前通过10 kDa MW截止过滤器（BioVision Cat#1997-25）。添加0-75µl的向孔中取样，并使用分析缓冲液将体积调节至75µl。

注：典型的尿液亚硝酸盐和硝酸盐水平在0.2-2mm和1-20µM范围内分别地典型正常血清水平分别为0-20µM和0-2µM各种疾病状态显著提高了这些水平。血浆样本或组织应使用不超过10µl的未稀释样品对匀浆进行分析。酚红细胞培养液中的血清可能会降低读数，从而形成标准曲线应使用相同的媒体制作。

3.向所有孔中添加5µl酶辅因子工作溶液。

4.向硝酸盐分析孔（未知和标准）中添加5µl硝酸还原酶，添加5测定时，用µl缓冲液代替硝酸还原酶（未知值和标准值）亚硝酸盐分开。

5.用盖子盖上平板，并在室温（RT）下培养1-4小时。1小时硝酸盐转化为亚硝酸盐的转化率约为90%，2小时转化率约为95%，4小时转化率约为99%转变

6.向每个孔中添加5µl增强剂。孵育30分钟以淬灭干扰化合物。

7.向每个孔中添加5µl DAN试剂。在室温下培养10分钟。

8.向每个孔中添加5µl NaOH。在室温下培养10分钟。

9在荧光计中使用Ex=360 nm和Em=450 nm读取板。