25-羟基维生素D3(HVD3) ELISA Kit

检测原理：

博尔森生物（BIOESN）生产的ELISA试剂盒采用抗体夹心法:将抗某蛋白抗体包被于酶标板上，标本和标准品中的某蛋白与抗体结合，加入生物素化的抗某蛋白抗体，再加入SABC复合物与生物素抗体结合，形成免疫复合物，然后加入TMB显色底物，显色剂显蓝色，最后加终止液变黄色，游离的成分被洗去。在450 nm处测OD值，某蛋白浓度与OD值之间呈正比，可通过绘制标准曲线计算出标本中某蛋白的浓度。

试剂盒组分: （保存温度4℃）

本试剂盒用于血清、血浆、组织匀浆、细胞培养上清液及其它生物体液。

标本收集与试剂准备: 

1. 血清、血浆样本收集应使用一次性的无热原，无内毒素试管（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝均可），血清、血浆避免使用溶血，高血脂标本，标本悬浮物应离心去除，使标本清澈透明。待测样本应尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-80℃）保存，避免反复冻融。

2. 洗涤液配置：用蒸馏水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的蒸馏水）

3. 标准品配制：取7个1.5ml离心管，分别标注1/2,1/4,1/8,1/16,1/32,1/64，blank。从第一至七管中分别加入标准品/样品稀释液200ul。在管中加入标准品溶液200ul，置于漩涡混合器上混匀后用加样器吸出200ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第六管中吸出200ul弃去，第七管为空白对照。

4.

5. 生物素化抗体工作液配置:使用前20分钟，用生物素化抗体稀释液将100×生物素化抗体稀释成1×工作液，根据所需用量配置，当日使用，剩余弃之。

6. TMB显色液的配置：使用前10分钟，将TMB显色液A液和B液1：1混合，避光放置备用。

7. 如果您检测的样本中靶蛋白浓度高于标准品最高值，建议重新检测，请根据实际情况，适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数)。

检测程序:

1. 加样：空白孔加入50μl标准品/样品稀释液，其余孔各加入标准品或待测样品50ul，将反应板混匀后置37℃，40分钟。

2. 洗板：用1×洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，每孔加入1×洗液350μl，每次震荡/浸泡1-2分钟，向滤纸上印干。

3. 空白孔加入100ul生物素化抗体稀释液，其余孔各加入1×的生物素化抗体工作液100ul，混匀后置37℃，30分钟。

4. 洗板：同上。

5. 每孔加入SABC复合物工作液100ul，混匀后置37℃，20分钟。

6. 洗板：同上。

7. 每孔加入提前配置好的TMB混合液100ul，混匀后置37 ℃暗处反应10-20分钟（具体显色时间根据显色结果而定）。

8. 每孔加入100ul终止液，混匀，30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

结果判断与计算：

1. 所有OD值建议减除空白值后再行计算，如空白OD低于0.1，也可以直接计算。

2. 以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，手工绘制或用软件绘制标准曲线，根据样品OD值计算出相应含量，再乘上稀释倍数即可。

试剂盒性能:

1、 检测范围：3.12-200ng/mL

2、 特异性:同时可检测重组或天然的某种蛋白或抗体，不与其它细胞因子有交叉反应。

3、 重复性:板内，板间变异系数均小于10%。

注意事项

1. 在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测，每次检测都应做标准曲线。

2. 洗涤过程很关键，洗涤不充分将导致精确度误差及OD值错误地升高，从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能 有结晶,属于正常现象，37℃水浴使结晶完全溶解后再配制洗涤液。

3. 检测时所有试剂都要恢复到室温，板条开封后剩余板条需封好，放回袋中2 个月内用完。

4. 试剂盒使用超敏TMB溶液，若显色过深会出现絮状物，属正常现象，不影响结果判读。

5. 仅用于科研，不能用于临床诊断！