线粒体提取试剂盒

线粒体提取试剂盒

一、产品简介。

线粒体是细胞内的双层膜系结构，含有少量 DNA 和大量能量代谢相关酶类，是细胞内的动力工厂，参与细胞内多种生物学效应。

本产品能够快速且完整的提取细胞内的线粒体，保持线粒体膜的完整性和线粒体内各种蛋白酶类的活性，用于后续的线粒体膜电位测定、酶活性检测，蛋白表达水平检测和亚细胞定位分析，也可用于线粒体 DNA 的提取等实验。

二、运输与存储条件。

本产品常温运输，4 ℃保存，有效期 12 个月。

三、特点与优势。

1. 本产品与 Thermo 公司的产品（89874）品质类似，可以快速分离提取线粒体。

2. 本产品提取的线粒体完整性好，产量大。

四、自备试剂与耗材。

PBS、RIPA 裂解液（不含 SDS）、2.0 ml 离心管、震荡混匀仪（Vortex mixer）、冷冻离心机。

五、使用说明。

1. 细胞收集。胰酶消化法收集贴壁细胞，或离心法直接收集悬浮细胞，每个样品含 2×107 细胞。

2. 低渗处理。加入 800 μl Reagent MA 试剂，震荡（Vortex）5 sec，重悬细胞。冰上孵育 2 min。（尽量不要超过 2 min，以免影响后续实验）

3. 细胞裂解。加入 10 μl Reagent MB，剧烈震荡（vortex at the maximum speed）5 sec，冰上孵育 5 min，每分钟剧烈震荡 1 次 （vortex，5 sec）。

4. 终止裂解。加入 800 μl Reagent MC，颠倒混匀几次，此步骤不要震荡混匀（No Vortex）。

5. 离心。700×g，4 ℃离心 10 min，弃沉淀（粗细胞核），上清转移到新的离心管中。。

6. 3,000×g，4 ℃离心 15 min，上清为细胞浆，沉淀为线粒体。细胞浆转移到新的离心管，可冻存。（若需提高线粒体产量，离心条件改为 12,000×g，4 ℃离心 30 min，可以加线粒体产量，但也会增加溶酶体和过氧化物酶体污染）

7. 洗涤线粒体。线粒体沉淀中加入 500 μl Reagent MC，轻轻震荡混匀，12,000×g，4 ℃离心 5 min，弃上清，沉淀即为纯化的线粒体。

8. 纯化的线粒体可立即用于测定膜电位，也可冻存在-80 ℃冰箱中。

9. 线粒体裂解。包括以下三种方式。

1) 变性裂解液裂解。利用本公司的细胞裂解液（Laemmli Buffer，2×，Cat：Omp-01）重悬线粒体沉淀，裂解线粒体，提取线粒体蛋白，用于后续的 western blot 分析。但提取蛋白已经变性，不可用于酶活性测定。

2) RIPA 裂解液裂解。利用温和的 RIPA 裂解液（不含 SDS）重悬线粒体沉淀，裂解线粒体，提取蛋白可以用于酶活性测定及 western blot 等实验。

3) 反复冻融法裂解。用 PBS 重悬线粒体，在-80 ℃冰箱或液氮中急速冻结线粒体溶液，37℃水浴锅中快速融化线粒体溶液，重复 3 次，完成线粒体裂解，提取蛋白可用于线粒体酶活性检测、western blot 等实验。

六、注意事项

1. 请用新提取的线粒体来测定膜电位，冻存后的线粒体，其膜的完整性受到破坏，不宜用于测定膜电位。

2. 整个实验需在低温条件下进行，所用试剂提前预冷。

3. 分离的细胞浆可以12,000×g，4 ℃离心15 min，弃沉淀，上清转移至新的离心管，即为纯化后的细胞浆。细胞浆纯化后可以减少溶酶体和过氧化物酶体的污染。

4. 细胞浆溶液中含有EGTA，不宜用BCA法测定蛋白浓度，请用Bradford法测定蛋白浓度。

5. 为了抑制蛋白降解，实验过程中可添加蛋白酶抑制剂（如cocktail等）。