上海臻科生物科技有限公司

                                                 规格：50管/24样

组织及血液酸性磷酸酶（acid phosphatase ，ACP）

活性测定试剂盒说明书

可见分光光度法

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

ACP在酸性条件下催化磷酸单酯水解称无机磷酸，常见于巨噬细胞的溶酶体内。ACP常用于前列腺癌的辅助诊断。

测定原理：

在酸性环境中，ACP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚，苯酚与 4-氨基安替和铁氰化钾反应生成红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定 510nm 吸光度增加速率，来计算ACP活性。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1 瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体×1 瓶，4℃避光保存。

试剂四：液体×1 瓶，4℃避光保存，变成蓝绿色不能使用。

标准品：液体×1 支，2μmol/mL 酚标准液，4℃保存。

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，4℃、8000g 离心10min，取上清液待测。

2. 血液可直接测定，或者适当稀释后测定。

测定：

1.分光光度计预热30min，调节波长到510nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于37℃水浴中预热30min。

3. 空白管：取EP管，加入20μL蒸馏水，200μL试剂二，200μL试剂三，混匀后置于37℃

水浴中保温15min；加入试剂四600μL，混匀后于510nm 测定吸光度，记为A空白管。

4. 标准管：取EP管，加入20μL标准品，200μL试剂二，200μL试剂三，混匀后置于37℃

水浴中保温15min；加入试剂四600μL，混匀后于510nm测定吸光度，记为A标准管。

5. 对照管： 取EP管，加入200μL试剂二，200μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；

加入试剂四 600μL，混匀； 最后加入20μL上清液，混匀后于510nm测定吸光度，记为A对照管。

6. 测定管：取EP管，加入20μL上清液，200μL试剂二，200μL试剂三，混匀后置于37℃

水浴中保温15min；加入试剂四600μL，混匀后于510nm 测定吸光度，记为A测定管。

注意：空白管和标准管只需做一次。

ACP  活性计算：

1. 组织中 ACP 活性计算

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol酚定义为1个酶活单位。

ACP(μmol/min/mg prot)= [C 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×V 反总]÷(Cpr×V 样)÷T=6.8×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管) ÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：37℃中每克组织每分钟催化产生1μmol酚定义为1个酶活单位。

ACP (μmol/min/g)= [C 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T= 6.8×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管) ÷W

C 标准品：2μmol/mL；V 反总：反应体系总体积（mL），1020μL=1.02 mL； Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司生产的 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），0.020mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W:样本质量，g；T：反应时间（min），15 min。

2. 血液中 ACP 活性计算

活性单位定义：37℃中每毫升血液每分钟催化产生1μmol 酚定义为1个酶活单位。

ACP活力(μmol/min/mL)= [C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总] ÷V样×V 样总÷T= 6.8×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)

C 标准品：2μmol/mL；V 反总：反应体系总体积（mL），1020μL=1.02 mL； V 样：加入反

应体系中上清液体积（mL），0.020mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间（min），

15 min。

注意事项：

1、试剂二、试剂三和试剂四均需避光保存。

2、试剂四变蓝绿色后不能再使用。

3、加入试剂四后必须立即混匀，否则显色不完全。

4、ACP不稳定，尤其在 37 ℃和 pH 大于7的条件下活力丧失快，因此酸性磷酸酶样品一般需当天准备；血清样品中，每毫升血清中加入10mg柠檬酸氢二钠或者5mg硫酸氢钠，使pH降至 6.5 以下，或 5ml血清加入30%醋酸溶液2 ～3滴，置于4 ℃可保存1周。