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柠檬酸合酶（citrate synthase，CS）试剂盒说明书

分光光度法

正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

产品内容：

试剂一：液体50mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂二：液体10mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂三：液体1mL×1 支，-20℃保存；

试剂四：液体50mL×1 瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×2 支，4℃保存，临用前加入800μL 无水乙醇，用不完的试剂4℃保存一周；

试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存，临用前加入1600μL 蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存；

试剂七：粉剂×2 支，-20℃保存，临用前加入800μL 蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存；

产品说明：

CS（EC 2.3.3.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，是三羧酸循环第一个限速酶，是三羧酸循环主要调控位点之一。CS 催化乙酰CoA 和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶A，进一步水解产生柠檬酸；该反应促使无色的DTNB 转变成黄色的TNB，在 412nm 处有特征吸光值。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水

操作步骤：

一、 样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

（1） 称取约0.1g 组织或收集500万细胞，加入1mL 试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

（2） 将匀浆600g，4℃离心5min。

（3） 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

（4） 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的CS（此步可选做）。

（5） 在步骤（4）中的沉淀中加入200uL 试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3 秒，间隔10 秒，重复30 次），用于线粒体CS 测定。

二、 测定步骤：

1、 分光光度计预热30min 以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。

2、 将试剂四、五、六和七在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。

3、 样本测定

    将上述试剂按顺序加入1 mL 玻璃比色皿中，加试剂七的同时开始计时，在412nm 波长下记录20 秒时的初始吸光度A1 和反应2min 后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

三、 CS 活性计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟催化产生1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=1100×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2） 按样本鲜重计算：

单位的定义：每g 组织每分钟催化产生1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

CS（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 样÷V 样总）÷T=222.2×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1 万个细菌或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

CS（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V 样÷V 样总）÷T=0.4444×ΔA

V 反总：反应体系总体积，9×10-4 L；ε：TNB 摩尔消光系数，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.03 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。