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乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl CoA carboxylase，ACC)试剂盒说明书

  （货号：ZK-0913F  分光法 24样）

一、产品简介：

乙酰辅酶A羧化酶（ACC，EC 6.4.1.2）广泛存在于生物界。在生物体内催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A，是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。

ACC催化乙酰辅酶A、NaHCO₃和ATP生成丙二酰辅酶A、ADP和无机磷，通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来测定ACC酶活性大小。

二、试剂盒组成和配制：

【注】：全程操作需无磷环境；试剂配置用新枪头和玻璃移液器等，也可用一次性塑料器皿，避免磷污染。

三、所需的仪器和用品：

可见分光光度计、1mL玻璃比色皿（光径1cm）、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。

四、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）活性测定：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、样本制备：

① 组织样本：称取约0.1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心15min，取上清，置冰上待测。

【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例提取

② 细胞样本：

先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；取500万细胞加入1mL提取液；超声波破碎细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；4ºC约12,000rpm离心10min，取上清作为待测样品。

【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（10⁴）：提取液（mL）为500~1000：1的比例进行提取。

2、上机检测：

① 可见分光光度计预热30min以上，设置温度37℃，调节波长至700nm，蒸馏水调零。

② 试剂放在37℃水浴5min；

③ 在EP管中依次加入：

④ 显色反应，在EP管中依次加入：

【注】若△A差值小于0.01，可增加样本取样质量W（如增至0.2g），或增加③步中样本加样体积V1(如由150μL增至300μL，则试剂一相应减少),或延长③步中37℃条件下孵育时间T（如由30min延至60min），则改变后的W和V1和T需代入计算公式重新计算。

五、结果计算：

1、标准曲线方程：y = 0.8474x - 0.0164，x是标准品摩尔质量（μmol/mL），y是△A。

2、按蛋白浓度计算：

定义：每小时每毫克组织蛋白分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。

酶活力(μmol/h/mg prot)= [(△A+0.0164)÷0.8474×V2]÷(V1×Cpr)÷T=8.03×(△A+0.0164)÷Cpr

3、按样本鲜重计算：

定义：每小时每克组织分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。

酶活力(μmol/h/g 鲜重)=[(△A+0.0164)÷0.8474×V2]÷(W×V1÷V)÷T

=8.03×(△A+0.0164)÷W

4、按细菌或细胞密度计算：

定义：每小时每1万个细菌或细胞分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。

酶活力(μmol/h/10⁴ cell)=[(△A+0.0164)÷0.8474×V2] ÷(500×V1÷V)÷T=0.016×(△A+0.0164)

V---加入提取液体积，1mL；    V1---加入样本体积，0.15mL； V2---酶促反应总体积，0.51mL；

T---反应时间，1/2小时；       W---样本鲜重，g；          500---细菌或细胞总数，500万；

Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。

附：标准曲线制作过程：

1 制备标准品母液（50μmol/mL）：标准品用1mL试剂一溶解。（母液需在两天内用）。

2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。

3 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。