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D-乳酸含量（D-lactic acid，D-LA）试剂盒说明书

（货号：ZK-0827W  微板法96样）

一、产品简介：

本试剂盒提供一种快速、灵敏的检测方法：D-乳酸在D-乳酸脱氢酶的作用下生成丙酮酸，并使NAD⁺还原生成NADH；为了使该反应顺利进行另添加酶进一歩分解丙酮酸；生成NADH与特异显色剂反应产生在450nm处有最大吸收峰的有色物质，通过检测该物质在450nm的增加量，进而计算出D-乳酸含量。

二、试剂盒组成和配制：

三、所需的仪器和用品：

酶标仪、96孔板、可调式移液器、天平、研钵、离心机。

四、D-乳酸（D-LA）含量测定：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、样本制备：

① 组织样本：0.1g组织样本，加1mL的提取液研磨，粗提液全部转移到EP管中， 12000rpm，离心10min，上清液待测。

【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例提取

② 细菌/细胞样本：

先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取500万细菌或细胞加入1mL提取液；超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；于4℃，12000g离心10min，取上清测定。

【注】：若增加样本量，可按细菌/细胞数量（10⁴个）：提取液（mL）为1000~5000：1的比例进行提取

③ 液体样品：a.近似中性的液体样品可直接取1mL转移到EP管中；12000rpm，离心10min，上清液待测。

b.酸性液体样本，则需先用KOH（5M）调溶液的PH值至约8，并在室温下孵育30分钟。取1mL转移到EP管中；12000rpm，离心10min，上清液待测。

④ 血清样本：澄清的血清样本可以直接检测。

2、上机检测：

① 酶标仪预热30min以上，调节波长至450nm。

② 临用前试剂一、二、三、四可按照比例20:10:130:10混成混合液（用多少配多少量），

下歩加样表中直接加170μL混合液。

③ 所有试剂解冻至室温（25℃）或在水浴锅（25℃）中孵育10min，在96孔板中依

次加入：

【注】1. 若样本自身有很强的背景值（如颜色很深或含有还原性物质如抗坏血酸等），可以加设一个样本自身对照：即试剂五用蒸馏水替代，其他试剂保持不变，则△A=A测定-A对照。

      2. 若△A值较小，可增加样本上样量V1（如增至40μL，则试剂三相应减少），则改变后的V1需代入计算公式重新计算。

3. 若△A值较大，或A测定超过了标曲最高点，可对样本用蒸馏水稀释，则稀释倍数D需代入公式计算；或减少样本上样量V1（如减至10μL，则试剂三相应增加），则改变后V1需代入公式重新计算。

五、结果计算：

1、标准曲线：y = 13.865x - 0.01；x为标准品摩尔浓度（μmol/mL），y为△A。

2、按照样本质量计算：

D-乳酸含量(µmol/g鲜重)=[(△A+0.01)÷13.865×V2]÷(W×V1÷V)=0.72×(△A+0.01)÷W

3、按细菌/细胞密度计算：

D-乳酸含量(μmol/10⁴ cell)=[(△A+0.01)÷13.865×V2]÷(500×V1÷V)=0.72×(△A+0.01)÷500

4、按照液体体积计算：

D-乳酸含量(µmol/mL)=[(△A+0.01)÷13.865×V2]÷V1=0.72×(△A+0.01)

5、按照血清体积计算：

D-乳酸含量(µmol/mL)=[(△A+0.01)÷13.865×V2]÷V1=0.72×(△A+0.01)

V---加入提取液体积，1 mL；             V1---加入反应体系中样本体积，0.02mL；

 V2---反应体系总体积，0.2mL；           W---样本质量，g；

500---细菌/细胞数量，万；                D---稀释倍数，未稀释即为1；     

D-乳酸分子量Mr---90.08。

附：标准曲线制作过程：

1 制备标准品母液（30μmol/mL）：临用前取1mL蒸馏水至2mLEP管中，再向1mL蒸馏水中加入3μL的标准品，混匀，即得标准品母液浓度为30μmol/mL。

2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5. μmol/mL。

3 依据测定管加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。