上海臻科生物科技有限公司

             β-葡萄糖苷酸酶 (β-glucuronidase,β-GUS  ) 试剂盒说明书

        (货号：ZK-0579W   微板法96样)

一 、产品简介：

β-葡萄糖苷酸酶(β-GUS,EC  3.2.1.31)是一种分布广泛的水解酶。在动物和微生物中都 有分布；但在绝大多数植物细胞和许多细菌及真菌内不存在内源GUS 活性，因而GUS 基因 广泛用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因。

β-葡萄糖苷酸酶(β-GUS)   水解对硝基酚-D-葡萄糖醛酸苷生成对硝基酚 (PNP),    通过检 测该产物在405nm 处的增加速率即可得出β-GUS 酶活性大小。

二、试剂盒的组成和配制：

三、所需的仪器和用品：

酶标仪、96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰。

四、β-葡萄糖苷酸酶(β-GUS)   活性测定：

1、样本制备：

①组织样本：取约0.1g 组织，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆。15000rpm,4℃     离 心10min,  取上清，置冰上待测。

【注】:若增加样本量，可按照组织质量 (g):   提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取

②细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细 胞，加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率20%或200W,  超声3s,    间隔10s,  重复30次);15000 rpm 4℃离心10min,  取上清，置冰上待测。

【注】:若增加样本量，可按照细菌或细胞数量 (10⁴个):提取液体积 (mL)  为500~1000:1的比例 进行提取。

2、 上机检测：

①酶标仪预热30min 以上，调节波长至405nm。

②所有试剂解冻至室温，在EP管中依次加入：

【注】1.若△A较小，可以增加37℃保温反应时间T(如增至1小时),或增加样本量V1(如增至40μL,  则试剂一相应减少),则改变后的T 和V1需重新代入计算公式计算。

1                              

2.△A 最好控制在标准曲线的线性范围内，若△A 的值超过1,可对样本进行稀释再测定，稀释

倍 数D 代入计算公式计算；或减少样本量V1 (如减至10μL, 则试剂一相应增加),或减少

37℃保温反应时间T  (如减至10min),    则改变后的T 和 V1 需重新代入计算公式计算。

五 、结果计算：

1、标准曲线：y=26.969x-0.0037,x      是标准品(PNP)    摩尔质量(μmol);y    是△A。

1.2

y=26.969x-0.0037 R²=0.9994

0.8 0.6 0.4

0.2

0.01      0.02      0.03      0.04

标准品(μmol)

0.05

2、按照样本质量计算：

酶活定义：在37℃下，每克组织每小时水解lμmoL 底物产生PNP 定义为1个酶活单位。

β-GUS  活性(μmoL/h/g  鲜重)=[(△A+0.0037)÷26.969]÷(W×V1÷V)÷T×D

=3.71×(△A+0.0037)÷W×D

3、按照样本蛋白浓度计算：

酶活定义：在37℃下，每毫克蛋白每小时水解 lμmoL 底物产生PNP 定义为1个酶活单位。 β-GUS(μmoL/h/mg  prot)=[(△A+0.0037)÷26.969]÷(CprxV1)÷T×D

=3.71×(△A+0.0037)÷Cpr×D

4、按细胞数量计算：

酶活定义：在37℃下，每10⁴个细胞每小时水解1μmoL 底物产生PNP 定义为1酶活单位。 β-GUS(μmoL/h/10⁴cell)=[(△A+0.0037)÷26.969]÷(500×V1)÷T×D=0.0074×(△A+0.0037)×D

5、 按 液 体 体 积 计 算 ：

酶活定义：在37℃下，每毫升液体每小时水解 lμmoL  底物产生PNP 定义为1个酶活单位。 β-GUS(μmoL/h/mL)=[(△A+0.0037)÷26.969]÷V¹÷T×D=3.71×(△A+0.0037)

W--- 样品质量，g;                                                     V-- 提取液体积，1mL;

V1---- 上清液体积 (mL),0.02mL;                               T-- 反应时间，30 min=1/2h;

D--- 稀释倍数，未稀释即为1;

Cpr--- 上清液蛋白质浓度， mg/mL;    建议使用本公司的BCA 蛋白质含量测定试剂盒。

附 ：标准曲线制作过程：

1      制备标准品母液(10μmoL/mL):     向标准品EP 管里面加入1mL 蒸馏水溶解，若有结晶析出，需 37℃水浴至完全溶解。

2      把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0,0.4,0.8,1.2,1.6,2μmoL/mL。也可根据实际样本来调整标 准品浓度。

3      依据20μL 的标准品+180 μL 的试剂一，再加200μL 的试剂三，于405nm 处读值；根据结果即可制 作标准曲线。

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